Amh基因在斑鳢性别分化和性腺发育的功能研究

Blotched snakehead (Channa maculata) is an economically important freshwater fish in China. Males grow much faster than females, which makes all-male population production highly valued in aquaculture. Therefore, the studies on the molecular mechanism of sex determination and differentiation in C. maculata has important application prospects. The reported researches and our previous results show that Anti-Müllerian hormone (Amh) plays important role in the progress of testicular differentiation and the maintenance of male gonad. Furthermore, there are clues indicating that Amh gene in C. maculata has some particularity in the function. In order to address these issues, the expression patterns of Amh in tissue and gonad development will be clarified through the experimental materials that we established before. Transcriptional regulatory elements of Amh will be identified by promoter analysis. In addition, in vivo gene knockout (loss of function in XY), overexpression (gain of function in XX), and exogenous hormones recovery will be carried out to figure out the functions of Amh in sex differentiation and gonad development in C. maculata. The gonad phenotype, variation of serum hormone levels, and expression of key genes that are sex-related will be analyzed from the loss and gain aspects. The implementation of this proposal will reveal the role of Amh in sex differentiation and gonad development of C. maculata, enriching the contents of sex determination and differentiation, and providing theoretical basis for the production of all-male snakeheads.

斑鳢（Channa maculata）是我国重要的淡水经济鱼类，雌雄生长具有性别二态性使得全雄单性养殖倍受重视，因此，其性别决定和分化的分子机制研究具有重要的应用前景。根据已有研究报道和我们的研究基础，发现Amh基因在精巢分化和维持过程中发挥重要作用，而且有线索表明斑鳢Amh基因在该过程的作用具备一定的特殊性。为了解决这些问题，本项目拟通过前期建立的斑鳢实验材料，阐明Amh在组织和性腺发育中的表达模式；通过启动子分析，鉴定Amh的转录调控元件；并采用基因敲除、过表达和激素回救的方法，从功能缺失和获得正反两个方面检测性腺表型、血清激素水平变化、雌雄性关键因子的表达变化等，解析Amh在性别分化和性腺发育过程的作用。本项目的实施有助于揭示Amh基因在斑鳢性别分化和性腺发育中的功能，丰富斑鳢性别决定和分化的研究内容，为斑鳢全雄单性育种生产实践提供科学依据。

斑鳢（Channa maculata）是我国重要的淡水经济鱼类，雌雄生长具有性别二态性使得全雄单性养殖倍受重视，因此，其性别决定和分化的分子机制研究具有重要的应用前景。本项目基于前期建立的斑鳢实验材料：XX雌鱼（XX-F）、XY雄鱼（XY-M）、激素诱导性逆转的XY伪雌鱼（XY-F）和YY超雄鱼（YY-M），采用组织切片和转录组测序对4种类型斑鳢的性腺进行分析，挖掘了大量精、卵巢差异表达基因（DEGs）和信号通路；结合转录本数据，利用qRT-PCR对40个DEGs进行验证，筛选到斑鳢性别分化和性腺发育相关基因，初步证实Amh、Dmrt1和Cyp17等基因与斑鳢精巢发育调控相关，Bmp15、Cyp19a1a和Foxl2等基因与斑鳢卵巢发育调控相关。克隆获得了2340 bp斑鳢Amh基因（CmAmh）的cDNA序列和8615 bp基因组序列。对XX-F、XY-M、XY-F和YY-M四种鱼不同组织的表达分析显示，CmAmh基因在XY-M和YY-M的精巢中高表达，显著高于其它组织中的表达量；在不同发育时期，CmAmh在精巢中的表达量高于卵巢，在135 dah时，CmAmh在精巢中的表达量达到最高；制备了Amh的多克隆抗体，抗体的内源性检测发现在XY-M精巢中70 kDa大小的条带，检测到强烈的Amh表达，在XX-F卵巢中有微弱条带，这个结果和RNA表达结果一致。利用BSP分析CmAmh基因启动子在这四种性腺组织中的甲基化情况，发现CmAmh在XY-M、YY-M精巢中高表达，其甲基化率低，基因表达与甲基化呈负相关。短期的性类固醇激素刺激下，无论是在雌鱼还是雄鱼中，CmAmh都会响应表达，呈波动变化；长期激素注射后，在雌性个体中，E2和MT注射后CmAmh的表达变化不大，在雄性个体中，E2会抑制CmAmh的表达，E2注射后CmAmh的表达呈下降趋势，MT注射增强了CmAmh的表达，其表达水平呈快速上升趋势；同时我们发现E2的长期注射会导致部分75 dah的XY鱼发生次生性性逆转，抑制了CmAmh的表达。利用人工授精和显微注射首次成功建立了斑鳢基因操作平台，初步建立了斑鳢Amh过表达和基因敲除模型，为进一步开展斑鳢Amh基因功能研究提供了良好基础，丰富斑鳢性别决定和分化的研究内容，为斑鳢全雄单性育种生产实践提供科学依据。