气味结合蛋白调控普通大蓟马嗅觉识别机制研究

The olfactory proteins are important for insects to communicate information with the outside environment. The specific of chemical odor molecules in the environment can be distinguished by antennae-related olfactory proteins which effect on feeding, mating, locating host plants, sheltering, selecting oviposition sites of insects. The thrips Megalurothrips usitatus (Bagnall) is the most important insect pest of leguminous crops, especially for cowpea in south China. Inscet chemotaxis could be as a good candidate measure for control thrips. However, the odorant binding proteins mediated the mechanism of olfactory recognition of M. usitatus was largely unknown. In the olfactory mechanism of M. usitatus as a starting point, combining the biochemistry with the molecular biology, we conducted a method for de novo assembly of M. usitatus transcriptome using short read sequencing technology (Illumina). And we also screened differentially expressed genes using tag-based digital gene expression system (DGE) from different volatile strains. Based on the analysis and identification of OBP differentially expressed genes, the temporal and spatial distribution of related genes expression was confirmed, and the protein binding affinity was also analyzed using fluorescence competitive binding assay.

昆虫触角中的气味结合蛋白在昆虫种内及与外界的信息交流中具有重要作用，它通过识别环境中特异性气味分子来调控昆虫觅食、寻偶、定位寄主、庇护和产卵等行为。普通大蓟马是我国南方豆科作物的重要害虫。利用昆虫趋化性，可以有效防治该害虫。然而，调控普通大蓟马的嗅觉行为机制仍不清楚。本项目围绕这一科学问题，拟采用行为学、生物化学与分子生物学相结合的方法，在明确普通大蓟马转录组基础上获得不同信息化合物作用下的触角基因表达谱，鉴定气味结合蛋白及其差异表达基因，确定其时空分布表达规律，并应用荧光竞争结合试验开展OBPs与气味信息分子的结合特性，揭示在普通大蓟马嗅觉识别中关键OBP基因的作用和功能。

豇豆是人们喜食的大宗蔬菜，在我国华南地区广泛种植且经济效益好，海南、广西常年种植面积达50万亩以上。近年来，普通大蓟马严重危害豇豆，给豇豆产业的健康可持续发展带来严峻的挑战。生产上防治普通大蓟马主要依赖化学防治，而抗药性问题已成为防治该虫的突出问题。为了探索有效防治手段，本项目基于昆虫的趋化性，研究了普通大蓟马嗅觉识别的行为机制，主要从（1）普通大蓟马触角感器观察研究；（2）普通大蓟马功能基因组测序分析；（3）普通大蓟马嗅觉相关基因克隆及生化特性分析；（4）普通大蓟马嗅觉相关基因时空、性别表达模式以及正在开展气味结合蛋白结合特性等方面开展了研究。普通大蓟马普通大蓟马触角为念珠状，分为8节，雌虫触角及各节均较雄虫更为发达。触角上共分布有9种不同类型的感器。普通大蓟马转录组测序获得了78,474条Unigene，N50长度为3,742 bp，经Blast数据库比对获得54,271条高注释可信度的Unigene。差异表达基因分析筛选出9,000~19,000个在两两不同发育阶段中显著性差异表达的基因，这些基因在普通大蓟马的生长发育、生理节律调控等方面发挥着重要作用。成功克隆3个普通大蓟马嗅觉相关蛋白基因cDNA全长序列和1个嗅觉相关蛋白基因的cDNA片段序列，分别命名为MusiCSP1、MusiCSP2、MusiOBP1、MusiOBP2。MusiCSP1、MusiCSP2、MusiOBP1全长cDNA序列分别为639 bp、708 bp、645 bp，开放阅读框分别为405 bp、405 bp、414 bp，分别编码134、134、137个氨基酸，预测成熟蛋白分子量分别为15.185、15.065、14.754 kDa，等电点分别为7.57、8.21、4.15，N端均含有19个氨基酸组成的信号肽。获得MusiOBP2的cDNA序列1014 bp，5’端不完整，经过生物学分析不具有完整的开放阅读框。各个基因在普通大蓟马各个发育阶段均有表达，但表达程度不一。MusiOBP1和MusiOBP2在雌虫中的相对表达量最高，其次若虫和雄虫，在预蛹期表达量最低；MusiCSP1在蛹期表达量最高，其次为若虫和雄虫，在雌虫表达量最低；MusiCSP2在蛹期和雄虫中表达量最高，其次是若虫期，雌虫中表达量最低。研究结果可为解析普通大蓟马嗅觉行为机制和研制昆虫行为调节剂提供理论依据。