形成杆状病毒多角体膜主要结构域的解析及其在抗紫外线方面的应用

Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) is known to be highly pathogenic for the several insect pests and safe for non-target organisms, whereas sensitiveness to UV radiation limits its application at a large scale. The polyhedron envelope, composed of carbohydrate and polyhedron envelope protein (PEP), is a major structure for the stability and persistence of baculovirus occlusion bodies (OBs). Baculovirus PEP contains the conserved N- and C-terminal regions and a middle-flexible region. In this project, we will reveal the roles of these regions in the formation of polyhedron envelope using yeast two-hybrid, Co-IP and immunofluorescence confocal microscopy. We will further identify the key domains which are capable of forming the intact polyhedron envelope and carrying exogenous proteins to surface of OBs by constructing a serial AcMNPV recombinants with different truncated fragments of PEP fused with the eGFP. Furthermore, we will construct AcMNPV recombinants which displayed nano-ZnO or melanin binding peptides on the surface of OBs. The anti-UV efficiency of these recombinants will be evaluated in the laboratory bioassays. These works will provide a new approach to protect the baculoviral insecticides against UV irradiation in the field conditions.

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）作为杀虫剂具有致病率高、宿主范围相对较宽、对非靶标生物安全等优点，但它对紫外线的敏感性极大地制约了其更大范围的应用。多角体膜是杆状病毒包涵体表面由多角体膜蛋白（PEP）和糖类组成的膜，对稳定包涵体的结构以及抵抗外界不良环境起重要作用。杆状病毒PEP由N端和C端保守区以及中间可变区组成，但这3个区域功能目前还不清楚。本项目通过酵母双杂交、免疫共沉淀、荧光共定位技术解析AcMNPV PEP的3个结构域在形成多角体膜过程中的作用，并通过构建含PEP不同截短片段的重组AcMNPV，揭示PEP形成多角体膜的最小功能域及其携带外源蛋白展示于包涵体表面的能力。在此基础上，构建PEP的功能域与抗紫外物质特异性结合肽融合的重组AcMNPV，通过展示于多角体膜上的多肽富集抗紫外物质，提高杆状病毒的抗紫外能力，为研发环境稳定的病毒杀虫剂提供基础。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）作为杀虫剂具有致病率高、宿主范围相对较宽、对非靶标生物安全等优点，但它对紫外线的敏感性极大地制约了其更大范围的应用。多角体膜是杆状病毒包涵体表面由多角体膜蛋白（PEP）和糖类组成的膜，对稳定包涵体的结构以及抵抗外界不良环境起重要作用。.本项目通过质谱和酵母双杂的方法，发现PEP与PK1、38K、ODV-e56、Ac51、Ac54、PH有相互作用，通过间接免疫荧光发现PEP还与P10有紧密联系。Phos-tag结果显示病毒感染过程中PEP存在高磷酸化状态但最终以去磷酸化和低磷酸化状态包装在包涵体上。病毒感染过程中PEP在PK1的作用下高度磷酸化，高度磷酸化的PEP入核后在38K的作用下去磷酸化，得到去磷酸化和低磷酸化的PEP，然后去磷酸化和低磷酸化的PEP通过与PH的相互作用包装到包涵体表面。截短实验发现PEP的N端结构域和中间区（NM区）能够形成完整的多角体膜。构建了AcMNPV PEP的NM区融合表达纳米氧化锌结合肽的重组病毒，与纳米ZnO混合后，盆栽实验显示特异结合纳米ZnO的重组病毒的在作物叶片上半数存活时间比仅混合了纳米ZnO的对照病毒的半数存活时间显著延长。.本课题通过对杆状病毒的代表种AcMNPV的多角体膜的形成机理进行初步研究，特异结合纳米ZnO的重组病毒的半数存活时间要比的对照病毒显著地延长，这种策略为提高杆状病毒在野外条件下的紫外线抗性提供了新的思路。