谷氨酸棒杆菌新型高效基因表达及打靶系统的构建

Corynebacterium glutamicum is not only an important industrial microorganisms that has been widely used in the production of a variety of cellular metabolites, but a desired host used to produce recombinant protein. The existing recombinant protein production systems have their own shortcomings. In this project, by constructing secretory expression vector pAU-4 harboring T7-lacO regulation region and engineering host strain C. glutamicum XU1 that Escherichia coli T7 RNA polymerase gene and LacI repressor protein gene were integrated on chromosome, optimizing recombinant protein production conditions, a high-efficient and stringent Corynebacterium glutamicum gene expression system would be estabished, which would provide a very promising way for the high-efficient production of recombinant proteins. Gene targeting technology based on RecA homologous recombination has not fully meet the needs of functional genomics，metabolic networks and their regulation and metabolic engineering studies for C. glutamicum. In this project, by constructing plamid pAU-6 harboring the Red homologous and FLP site-specific rocombination systems for C. glutamicum and optimizing gene targeting conditions, a simple and high-efficient new gene targeting system would be estabished, which would provide a new method to the research for C. glutamicum.

谷氨酸棒杆菌是一种广泛用于各种细胞代谢产物生产的重要工业微生物，同时，也是一种理想的重组蛋白生产宿主菌。目前使用的原核重组蛋白生产系统都有各自的缺陷。本项目通过构建使用T7-lacO调控区的分泌型表达载体pAU-4，以及染色体上整合大肠杆菌T7 RNA聚合酶基因和LacI阻遏蛋白基因的工程宿主菌株C. glutamicum XU1，优化重组蛋白生产条件，建立一套谷氨酸棒杆菌高效严谨基因表达系统，为重组蛋白高效生产提供一条非常有应用前景的新途径。基于RecA同源重组的基因打靶技术已不能完全满足谷氨酸棒杆菌功能基因组学、代谢网络及其调控和代谢工程研究的需要。本项目通过在谷氨酸棒杆菌中构建Red同源重组系统pAU-6以及FLP位点特异性重组系统pAU-8，优化打靶条件，建立一套简单高效的新型谷氨酸棒杆菌基因打靶系统，为谷氨酸棒杆菌的基础和应用研究提供一套简单高效的基因打靶新方法。

谷氨酸棒杆菌是一种理想的重组蛋白生产宿主菌。项目构建了一套基于启动子tac-M与谷氨酸棒杆菌RNA聚合酶互作的组成型基因高效表达载体pAU3, pAU4和pAU5，它们都使用tac-M强启动子来控制基因的组成型转录，使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点(RBS)一致序列来起始蛋白质的翻译。pAU4不含信号肽，是非分泌型表达载体；pAU3是Tat分泌型表达载体，其使用谷氨酸棒杆菌强cgR_0949信号序列介导蛋白质的Tat途径分泌；pAU5是Sec分泌型表达载体，其使用强cgR_2070 信号肽序列介导蛋白质的Sec途径分泌。构建了一套基于T7启动子与T7 RNA聚合酶互作的诱导型基因高效表达载体pAU12、pAU13和pAU14。这三个载体上都包含T7 RNA聚合酶和LacI阻遏蛋白编码基因，并且使用T7-lacO杂合启动子来控制目的基因的转录，使用谷氨酸棒杆菌RBS一致序列来起始蛋白质的翻译。IPTG的存在能诱导克隆在载体上的目的基因高效表达。非分泌型表达载体pAU13的不含有信号肽序列；Tat分泌型表达载体pAU12使用cgR_0949 信号序列来介导蛋白质的胞外分泌，Sec分泌型表达载体pAU14 cgR_2070信号序列来介导蛋白质的胞外分泌。构建了用于克隆极毒基因的严谨控制型表达载体pAU10。 pAU10利用高效可控制的T7-lacO启动子/操纵子和强转录终止子rrnBT2的组合来严格控制极度毒性基因的转录。同时，与T7启动子方向相反的trp启动子/操纵子产生的反义RNA能阻断少量渗漏目标mRNA的翻译。在培养基中未添加IPTG和L-色氨酸的情况下，极毒性基因的渗漏表达被严格阻止；当添加IPTG和L-色氨酸后，能够高效表达极毒蛋白。构建了用于外源质粒高效转化的大肠杆菌中间宿主E.coli AU1。 E.coli AU1染色体上整合了源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032限制修饰系统glIR-cglIIR-cglIM的甲基转移酶编码基因cglIM，该基因能够使大肠杆菌AU1赋予质粒特异性的cglIM甲基化模式。抽提自该中间宿主菌的质粒对能够抵抗谷氨酸棒杆菌胞内限制酶glIR的降解，高效转化谷氨酸棒状杆菌。本项目的研究成果为谷氨酸棒杆菌限制性内切酶基因的克隆，异源质粒的高效转化以及重组蛋白高效生产奠定了坚实的基础。