SLC25A22通过调节组蛋白/DNA甲基化修饰促进KRAS突变型大肠癌的分子机制研究

Colorectal cancers (CRC) frequently harbour concomitant mutations in KRAS and APC that promote carcinogenesis. Our preliminary data showed that simultaneous APC loss-of-function and KRAS gain-of-function mutations in CRC cells induced a shift in metabolism towards glutamine addiction. This led to decreased α-ketoglutarate-to-succinate/fumarate ratios that are inhibitory for histone demethylases (JmjC-domain containing demethylases, JMJD) and DNA demethylases (ten-eleven translocation enzyme, TET enzyme). Consequently, we observed that multiple histone methylation sites were increased in KRAS mutant CRC cell lines as compared to their isogenic KRAS wildtype counterparts; whereas 5hmC, the product of TETs, was suppressed in the presence mutant KRAS. Moreover, we demonstrated that SLC25A22, a mitochondrial glutamate transporter, plays a novel role in mediating KRAS-induced deregulated metabolic profile and histone/DNA methylation in CRC. In this study, we aim to 1) determine the role of SLC25A22 in mutant KRAS CRC tumorigenesis via the modulation DNA methylation and histone methylation; 2) evaluate the functional role and epigenetic effect of SLC25A22 in APC-KRAS driven CRC in vivo by the knockout of SLC25A22 in APCmin-KRASG12D mice; and 3) investigate association between SLC25A22 and histone/DNA methylation in a large cohort of CRC patients. These efforts will identify a novel mechanism through which SLC25A22 contribute to tumorigenesis in KRAS-mutant CRC and consolidate SLC25A22 as a molecular target in KRAS mutant CRC, which paves the way for rationale drug development for CRC.

KRAS突变在大肠癌中起重要作用。前期工作发现：1）KRAS突变促进大肠癌细胞发生谷氨酰胺成瘾；2）KRAS突变提高大肠癌细胞组蛋白甲基化水平，降低TET酶去甲基化活性；3）SLC25A22在大肠癌调节KRAS突变所致异常细胞代谢和组蛋白/DNA甲基化，敲除该基因抑制KRAS突变对细胞的影响。推测SLC25A22通过调节组蛋白/DNA甲基化，促KRAS突变型大肠癌生长。本研究拟通过表观遗传分析技术，阐明SLC25A22异常调控表观遗传促KRAS突变型大肠癌生长的分子机制；利用Slc25a22基因敲除小鼠，在动物体内评价SLC25A22在KRAS突变型大肠癌中的生物学功能和表观遗传效应；利用大肠癌组织样本，在患者体内评估SLC25A22与组蛋白/DNA甲基化修饰间的关联。完善KRAS突变型大肠癌的发病机制，明确SLC25A22是KRAS突变型大肠癌的新型靶标，为大肠癌的诊治提供重要理论依据。

项目的背景：KRAS突变是大肠癌最主要的致癌突变之一，其能协同WNT通路上相关基因突变共同促进大肠癌的发生和发展。我们前期研究发现SLC25A22对于KRAS调控的线粒体谷氨酸盐的代谢起了关键的作用。在本课题研究中，我们旨在阐明SLC25A22通过细胞代谢和表观遗传调节，促进KRAS突变型大肠癌生长的分子机制。.主要方法：我们创建了肠道特异性敲除 SLC25A22 的 ApcminKrasG12D 小鼠。收集肠组织并通过组织学、免疫组织化学和 DNA 甲基化测定进行分析。在表达突变 KRAS 的结肠上皮细胞 (1CT) 和大肠癌细胞 (DLD1、DKS8、HKE3 和 HCT116)，研究敲除 SLC25A22对增殖、集落形成和细胞凋亡的影响。通过 RNA 测序和甲基化芯片，分析对基因表达和表观遗传学的影响。通过液相色谱-质谱法分析 [U-13C5]-谷氨酰胺的代谢轨迹。我们对来自香港的 130 名患者（57 名患有 KRAS 突变）的结肠直肠肿瘤样本进行了免疫组织化学分析，并对生存率进行了 Kaplan-Meier 分析。.重要结果和关键数据：KRAS突变性大肠癌细胞需要谷氨酰胺才能生存。谷氨酰迅速被纳入三羧酸循环；而这个过程需要 SLC25A22。作为线粒体谷氨酸盐转运蛋白的SLC25A22，能够在KRAS突变介导的谷氨酰胺分解代谢的影响下，上调琥珀酸盐与α-酮戊二酸（α-KG）的比值，抑制DNA和组蛋白去甲基化酶的活性，提高结直肠癌细胞DNA和组蛋白的甲基化水平，诱导WNT/β-catenin相关的肿瘤干性标记（如LGR5），促进结直肠癌的发展。我们首次建立结肠特异性Slc25a22基因敲除小鼠模型（ApcMin/+KrasG12D/+Slc25a22KO），从体内实验验证了敲除Slc25a22能使肿瘤细胞失去干性，显著抑制KRAS突变型结直肠癌的发生。而肿瘤干性与肿瘤耐药密切相关，因此敲除SLC25A22恢复了KRAS突变型结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性，增加了抗癌效果。SLC25A22的表达水平是判断KRAS突变型大肠癌生存预后的独立危险因子。.科学意义：我们的工作首次证实了在KRAS突变型结直肠癌中SLC25A22驱动的谷氨酰胺分解代谢会导致琥珀酸盐的积累，通过表观基因组的修饰，维持结直肠癌的干性，促进肿瘤发生。SLC25A22是KRAS突变型结