一氧化氮（NO）调节CsRAC1和CsRAC5信号途径参与低温抑制茶树花粉管生长机制的研究

Our previous findings have shown that Camellia sinensis pollen could germinate and grow under low-temperature stress, and nitric oxide (NO) was confirmed to be involved in the process. In addition, we found that CsRAC1 and CsRAC5, two special small GTPase, play different roles in the process of NO regulating C. sinensis pollen tube growth under low-temperature, but the mechanism remains unclear. Therefore，this project is designed to research the following works: Cloning the cDNA full length and analyzing the expression pattern of CsRAC1 and CsRAC5 in the process of C. sinensis pollen tube growth under low-temperature stress or NO treatment; Purifying CsRAC1 and CsRAC5 proteins and making antibodies, thereby analyzing the location, quantification and activity of two small GTPase; Verifying the function of CsRAC1 and CsRAC5 in C. sinensis pollen tube response to low-temperature and NO treatment by stably expressing CsRAC1/CsRAC5, DN-CsRAC1/DN-CsRAC5 (artificial mutant gene of CsRAC1 and CsRAC5) in Arabidopsis thaliana and transiently expressing them in Nicotiana tabacum pollen tubes; Screening interacting proteins of CsRAC1 and CsRAC5, and then analyzing the regulatory mechanisms of NO on the interaction mode between two small GTPase and their interacting proteins in low-temperature stress inhibited C. sinensis pollen tube growth by single-molecule fluorescence imaging based on a tracking algorithm. The results of this project will reveal the underlying mechanism of CsRAC1 and CsRAC5 response to the process of low-temperature stress inhibiting C. sinensis pollen tube growth regulated by NO, which will highlight the mechanism of low-temperature tolerance in plant reproductive tissue.

本人前期研究表明，NO信号途径参与调节低温下茶树花粉的萌发生长，而小G蛋白CsRAC1和CsRAC5以不同的模式参与上述过程，但其机制仍不清楚。本项目拟开展以下研究工作：克隆CsRAC1和CsRAC5的cDNA全长，分析其在低温和NO处理的花粉管生长过程中的表达模式；纯化CsRAC1和CsRAC5蛋白并制备抗体，分析不同处理下花粉和花粉管中两个小G蛋白定位、定量和活性变化；获得无活性的DN-CsRAC1和DN-CsRAC5基因，将其同正常基因分别转入野生型和突变体拟南芥，同时瞬时表达于烟草花粉管中，验证NO和低温处理下CsRAC1和CsRAC5的功能；筛选两个小G蛋白的互作蛋白，用基于追踪算法的单分子成像技术探讨低温胁迫下NO对两个小G蛋白与其互作蛋白相互作用的调控机制。本项目旨在探讨CsRAC1和CsRAC5响应NO调节低温抑制花粉管生长的机制，为植物生殖器官抗寒机制研究提供科学参考。

NO作为重要的信号分子能够通过调节小G蛋白信号途径参与茶树响应低温胁迫的过程，但其机制仍不清楚。本项目在前期研究的基础上，通过克隆CsRAC1和CsRAC5，利用细胞生物学和分子生物学技术研究了CsRAC1和CsRAC5的功能。同时，进一步利用miRNA组学和分子生物学技术研究NO在低温胁迫下茶树体内作用机制。主要结果如下：.提取茶树RNA，克隆了茶树的两个小G蛋白基因CsRAC1和CsRAC5，其开放阅读框分别为591 bp和594 bp，分别编码197个和198个氨基酸，并均定位在细胞膜和细胞核上。CsRAC1和CsRAC5的表达受多种非生物胁迫的调控，表明CsRAC1和CsRAC5参与了茶树的多种非生物胁迫响应。CsRAC1的过表达增加了拟南芥对盐胁迫的敏感性，提高了生殖生长阶段拟南芥对干旱胁迫的耐受性，增强了ABA对拟南芥种子萌发的抑制作用。此外，CsRAC1调节的抗氧化系统主要在生殖生长阶段的拟南芥中起作用。CsRAC5明显提高了拟南芥对盐胁迫和ABA处理的敏感性且呈现梯度依赖效应，且降低了拟南芥在干旱胁迫初期的抗旱能力。.在NO供体SNAP、NO清除剂PTIO和NO合酶抑制剂L-NNA处理后，发现SNAP可提高处理过程中多种GAGB代谢相关酶活性及相关基因的表达水平。SNAP处理24 h提高了腐胺和亚精胺含量，PTIO处理12 h提高了精胺含量，SNAP和L-NNA处理48 h提高了脯氨酸的积累，这表明茶树中存在其他NO生物合成途径。此外，NO加速了低温响应过程中GABA的消耗。这表明，不同生物合成途径来源的NO可能通过调节GABA支路和脯氨酸的代谢增强茶树的耐寒性。.花粉管在常温CK、低温LT及NO处理培养后，收集并提取RNA，分析发现LT和NO处理分别诱导了77个和71个差异表达miRNA。GO富集分析表明，低温诱导了与微管和肌动蛋白相关的miRNA，而NO诱导了与氧化还原过程相关的miRNA。此外，大部分LT和NO共调控的miRNA的靶基因富集于金属离子结合和转运以及细胞壁组分，并可通过胼胝质和纤维素的沉积以及碳水化合物的代谢从成分分布、细胞结构和能量供给等方面调控茶花粉管的生长。这表明以NO为主的复杂信号网络介导了低温抑制的茶树花粉管生长。