结核分枝杆菌LrpA蛋白调控基因转录的机制研究

Tuberculosis is an important zoonotic disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which has greatly threatened human health. The transcription regulator protein LrpA might play a role in Mtb persistence, but the mechanism of transcription regulation of LrpA in Mtb is not clear. In this study, we will find out the new regulon of LrpA on the whole genome of Mtb by Chromatin Immunoprecipitation coupled to sequencing (ChIP-seq) and confirm binding in vitro through Electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Meanwhile, the chemical footprinting technique will be applied to identify the binding region between DNA and LrpA. LrpA will be overexpressed in Mycobacterium smegmatis or Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) and the selected gene transcription will be analyzed through qRT-PCR to confirm the target genes which is regulated by LrpA. The novel small molecules which can be taken as environment signal will be screened using EMSA. The crucial bases located at the promoter region of new identified targets which play an important role for LrpA binding is to be explored with depurination, depyrimidation and methylation binding interference techniques. Finally, the high-resolution map can be established. In short, the transcription regulation mechanism study of LrpA during Mtb persistence will strongly support the drug development in the future.

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种重要的人畜共患传染病，严重危害人类健康。转录调控蛋白LrpA在结核分枝杆菌的持留中起到重要作用，但其转录调控机制尚不明确。本项目拟应用染色质免疫共沉淀结合高通量测序方法(ChIP-seq），鉴定该蛋白在基因组上新的调控子，以凝胶滞后试验（EMSA）进行体外验证，并通过化学足迹法验证LrpA与目的基因结合区域；在耻垢或卡介苗中过量表达该蛋白，通过qRT-PCR方法分析目的基因的表达水平差异，确定LrpA真正调控的基因；以滞后试验筛查LrpA新的辅助因子，明确新的小分子作为该蛋白的环境信号调控目的基因的表达水平；应用去嘌呤、去嘧啶和甲基干扰试验，定位受调控基因的启动子区域与LrpA互作中起到重要作用的碱基，进而绘制高分辨蓝图。本项目通过对LrpA在细菌持留中转录调控机理的研究，将为后期的药物开发提供强有力的理论依据。

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种重要的人畜共患传染病，严重危害人类健康。转录调控蛋白LrpA在结核分枝杆菌的持留中起到重要作用，但其转录调控机制尚不明确。本项目主要应用凝胶滞后试验（EMSA）、qRT-PCR, 分子对接、生物信息学分析等方法对LrpA的潜在的调控机理进行研究，主要结果如下：（1）体外验证了预测的LrpA的20个结合位点，其中有17个基因的启动子与该蛋白结合；（2）根据结合的这17个位点构建了DNA结合保守序列，发现位置1、6、8和12相对保守，并通过点突变体外验证了这四个位点在蛋白与DNA的结合中起到至关重要的作用；（3）组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸抑制了DNA与该蛋白的结合，维生素B1、B3、B6、VC、B7、B9、B12、VA和VK3均可以降低MtbLrpA与启动子rv3919c的结合能力，但B5、胆碱和VE则不能；（4）分子对接数据分析结果显示Gly-102和Asp-82是口袋中相对重要的残基，参与了大多数与配体的氢键作用；（5）qRT-PCR方法分析了LrpA潜在的受调控的目的基因的表达水平，提出了LrpA可能的调控作用模式。本项目通过对LrpA在细菌持留中转录调控机理的研究，将为后期的药物开发提供强有力的理论依据。