利用高通量基因组技术寻找特异性调控猪肌内脂肪沉积的miRNA及其靶mRNA

探讨如何在高瘦肉率(低背膘厚)的前提下，提高肌内脂肪(IMF)含量以改良猪肉品质是全球育种学家目前正面临的一大难题，其"瓶颈"在于找到特异性调控IMF沉积的调控因子和功能基因。本课题首先利用激光显微捕获(LCM)技术从肌肉中分离出高纯度的IMF细胞，并采用线性扩增方法获得足够且高质量的RNA。然后，对脂肪特异性表达的所有miRNA和mRNA分别进行高通量测序和基因芯片检测。利用2008年底公布的猪基因组序列，在发现新miRNA的基础上，采用"表达谱联合分析"这一前沿策略，结合表型性状筛选和预测特异性调控IMF沉积的miRNA及其靶mRNA，并通过荧光素酶报告系统予以具体验证。以期从基因表达调控的整体特征出发，全面深入地阐明不同部位脂肪沉积的分子机理。本研究不仅可为猪IMF的研究提供新思路，为猪miRNA的研究积累新资料，更重要的是为后续利用基因工程技术改良猪肉品质提供可靠的科学依据。

不同部位的脂肪组织由于受到体内局部环境的具体影响，在内分泌特性、细胞形态特征和脂肪动态沉积平衡等方面存在明差异。探讨如何在保证较低皮下脂肪和内脏脂肪沉积的前提下维持一个合适的肌内脂肪含量，实现猪胴体和肉质性状的共同改良已成为全球猪育种学家所面临的一大难题。同时，人类肥胖相关研究已经证明，相对于皮下脂肪，内脏脂肪对人类的新陈代谢相关疾病和并发症具有更加明显的危害。猪与人类在解剖学特征、器官大小和能量代谢等多种生理生化特征方面存在较高的相似性，是理想的人类肥胖相关疾病的动物模型。本项目以不同品种猪不同部位脂肪组织作为研究对象，采用“表达谱联合分析”策略，结合表型性状指标筛选和预测特异性调控不同部位脂肪组织沉积的miRNA及其靶mRNA，通过荧光素酶报告系统予以具体验证，并在此基础上采用MeDIP-seq技术进一步分析候选miRNA-靶mRNA启动子区域的甲基化差异,进一步鉴定特异性调控不同部位脂肪沉积的功能基因及其调控miRNA。本项目研究成果对猪脂肪特异性调控的miRNA信息资源进行了大幅补充。Pre-miRNA序列增至867条，成熟体miRNA序列增至1,004条，其中特异miRNA序列达到777条，并进行了详尽的生物信息学分析，提供了有关miRNA的末端序列变异，miRNA前体结构，染色体定位，特定发育阶段的miRNA表达，以及miRNA保守性等详细信息。针对筛选出的具有潜在研究价值的miRNA及其靶功能基因，采用抑制和过表达实验在细胞水平验证其具体功能，并进行荧光素酶报告基因检测以寻找miRNA对靶基因（重要功能候选基因）位点的作用性。在原代培养猪前脂肪细胞和成肌细胞并成功诱导分化的基础上，采用miRNA的过表达和抑制技术，明确了miR-27a，miR-143 和miR-369这3个miRNA对猪脂肪细胞甘油三酯沉积的调控方式。并采用双荧光素酶报告基因系统证明脂肪特异性表达的ssc-miR-369直接调控猪的TNF-α基因，从而控制皮下脂肪和内脏脂肪沉积，进而影响瘦肉率。本项目研究成果从转录前和转录后两个调控层面全面深入地阐明不同部位脂肪沉积的分子机理，不仅为猪重要经济性状的功能基因组学研究积累了新资料，同时为人类肥胖相关疾病的分子机理提供了借鉴资料。