II型PRRSV重要抗原表位的筛选及其生物学功能的研究

Porcine reproduductive and respiratory virus (PRRSV) contribute to be a threat to the pig industry worldwild. After infected, PRRSV can induce apoptosis to the target cell, cause the persistent infections and antibody-mediated enhanceman. The amino of PRRSV may consist immunodominant "decoy" epitops, and the N-linked glycosylation site of GP5 protein can constitude the so-called gly-shielding phenomenon. Meanwhile, PRRSV appears to evolve by random mutation easily and have complicated genotypes and phnotypes. Because of these characteristices, virus domestication, inactivated vaccine, vector vaccine and polyvalent vaccine, new adjuvents, recombinant virus saving and "sterilizing" immunnity were used to prepare high effectiveness viccines and clean up virus. Owing to the potential risks of those different methods, domestic classic PRRSV type II monoclone antibodies were used to interact with "Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library" to screen the important epitopes of PRRSV in this reseach, which may have the biological activities of immunological prevention and disease detection. When the small piptides accquied from this reseach are used to inoculate annimals, mutation and pathogenicity of virus, interference of vectors, low cellular immunity of inactivated vaccines and biological safty risk of recombinant virus can be all avoided. So the results of this reseach will provide new clues to viccine preparation, rapid diagnosis method development and pathogenesis mechanism exploring.

猪繁殖与呼吸道综合征病毒感染宿主后可诱发靶细胞凋亡；可使宿主出现持续带毒现象和抗体依赖性增强现象；病毒自身氨基酸可组成"诱骗表位"；病毒GP5结构蛋白的糖基化位点可产生"多糖屏蔽现象"。同时，病毒自身易突变，并存在多种基因型和表现型。目前多采用驯化病毒，制备灭活疫苗、载体疫苗和多价疫苗，研制新型佐剂，构建重组病毒及建立清除性免疫等方法用于该病毒高效疫苗研究和病毒净化。鉴于各种方法存在的潜在风险，为避免活病毒自身的突变性和致病性、避免外源载体的免疫干扰性、避免灭活病毒低细胞免疫诱导性以及重组病毒的生物安全风险性，本研究将借助小分子"多肽"的帮助，首次应用国内经典II型PRRSV毒株全病毒单克隆抗体与"噬菌体随机12肽库"相互作用，进行病毒重要表位的筛选，以期待获得用于免疫防治和检测方法研究的具有较好生物活性的小分子短肽，旨在为新型疫苗的研发、快速诊断方法的研究以及致病机理的探寻提供新的线索。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）非结构蛋白7（nsp7）被认为可以作为理想的靶分子用于PRRSV血清学诊断方法的建立。原因由于该蛋白在大肠杆菌表达系统中，可以可溶形式表达；机体感染PRRSV后，nsp7抗体可持续存在至感染后202天；在同一基因型病毒之间nsp7编码蛋白非常保守，不同基因型之间差异较大。另有研究表明，以nsp7蛋白为抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）与目前全球广泛使用的Idexx ELISA试剂盒检测方法具有非常高的一致性。以上证据表明，nsp7可作为重要的检测因子，用于PRRSV的检测，但到目前为止，该蛋白免疫活性、生物功能及其抗原表位分布情况还没有明确研究结果。本研究首先获得nsp7可溶性重组蛋白，以其为抗原制备了效价高、特异性强的抗nsp7蛋白兔源多克隆抗体。实验结果显示，该多克隆抗体可以和大肠杆菌表达的nsp7α、nsp7β重组蛋白发生特异性结合，并有效用于病毒感染Marc-145细胞后其nsp7蛋白分布情况的原位检测；不同稀释倍数的抗nsp7多克隆抗体均可对病毒的复制产生抑制作用。应用噬菌体随机肽库淘选技术对PRRSV nsp7蛋白进行特异性亲和多肽的筛选。经过6轮生物淘选后，获得5条共有十二肽序列。其中噬菌体4和5展示的多肽共同含有一致的多肽序列CD##WC。根据筛选噬菌体与nsp7的结合能力，合成三条多肽，并对部分多肽进行FITC标记。免疫荧光结果表明，三条多肽可用于感染细胞中nsp7的检测；病毒抑制试验表明，多肽5和6表现出有效的病毒抑制能力，并在感染后36和48h时，其抑制作用表现出剂量依赖性。选用FITC标记的多肽5用于nsp7在感染细胞内定位的检测。结果发现，该蛋白在PRRSV感染细胞内主要分布于细胞核周围，与nsp7单抗检测结果一致。同时，本研究制备三株nsp7特异性单克隆抗体，该单抗可用于nsp7在PRRSV感染组织内和感染细胞内的生物检测。并应用噬菌体随机肽库淘选技术对其进行筛选，以探寻nsp7抗原分布特性，结果表明，本研究所发现的表位位于type II PRRSV nsp7β中，序列为N153AWGDEDRLN162，该表位可用于PRRSV阳性血清的检测。今后研究中，可围绕该表位建立PRRSV新型检测方法，以及探索可用区分灭活疫苗度和野毒，以及区分I型和II型PRRSV的检测方法的研究。