中国汉族人原发性远端肾小管酸中毒V型H+-ATP酶B1亚基与a4亚基基因突变及相关功能研究

远端肾小管酸中毒（dRTA）是由于远端肾小管酸化功能障碍引起的以高氯性代谢性酸中毒为特点的临床综合征，主要表现为低血钾、代谢性酸中毒、骨质疏松、肾结石等。目前已有研究证实原发性dRTA可由编码负责氢离子转运的V型H+-ATP酶的B1（ATP6V1B1）与a4亚基(ATP6V0A4)的基因突变导致，表现为常染色体隐性遗传。本研究已通过采用直接测序的方法发现该疾病相关基因ATP6V0A4与ATP6V1B1新的突变位点；拟选取本研究中发现的突变位点在细胞、分子和动物水平进行研究：将失活的突变位点异源表达于小鼠肾脏IMCD细胞中，研究各突变型基因与功能表达的联系，并挑选部分突变位点构建转基因小鼠模型。本课题对于揭示原发性远端肾小管酸中毒的发病机制，基因型与表型之间的关系有重要意义，且本研究拟构建的转基因小鼠模型可能成为研究骨质疏松的新模型，有良好的应用前景。

本研究建立了了国内外最大组原发性dRTA的临床资料库，对其中66例患者包括12个dRTA家系，散发患者46例进行了dRTA的致病基因ATP6V0A4、ATP6V1B1及SLC4A1进行了筛查。发现了ATP6V0A4基因的SNP5个，单纯杂合变异2个(M580T、A630I)，ATP6V1B1基因的SNP9个，发现三个已知SLC4A1突变(R589C, R589H, G609R），突变发现率明显低于文献报道。在功能研究方面，构建成功含有R449H、P524L、M580T突变的ATP6V0A4-pEGFP-N1质粒及R589C突变的SLC4A1-pIRES2-EGFP Vector质粒，并将其表达在HEK293t细胞，野生型ATP6V0A4融合蛋白与三种突变型ATP6V0A4融合蛋白均可以与内质网标志物calnexin共定位，野生型ATP6V0A4融合蛋白与R449H、M580T ATP6V0A4融合蛋白可以与高尔基体标志物GM130共定位，而P524L ATP6V0A4融合蛋白不能与GM130共定位。野生型ATP6V0A4免疫沉淀产物可以与E亚基结合，但是突变型ATP6V0A4免疫沉淀产物均不能与E亚基相结合。野生型AE1蛋白和R589C突变型与内质网的标志物Calnexin 以及高尔基体标志物GM130均有共定位（图6）。对野生型以及突变型AE1蛋白在细胞内的表达用WESTERNBLOT分别检测总蛋白以及膜蛋白中的表达情况，我们发现在总蛋白中表达无明显差异，而在膜蛋白中表达明显减少。结果证实这些突变为失功能性突变。