心脏内源性生物钟调控肌浆网RyR2对慢性心衰室性心律失常昼夜节律的影响与机制研究

Chronic heart failure (CHF) patients are susceptible to ventricular arrhythmia (VA) and sudden cardiac death (SCD), which shows apparent circadian rhythm. Biological clock contributes significantly to this phenomenon. However, the underlying mechanism remains unclear. Our preliminary experiments found the circadian rhythm of calcium transients in cardiomyocytes. In addition, we observed the "morning peak" of programed electrical stimulation (PES)-induced VA was abolished by chronomodulated treatment of RyR inhibitor dantrolene. Therefore, we hypothesized that cardiac biochronometer modulated the calcium transients via regulation of Clock-Bmal1 on RyR2 and this process was responsible for the diurnal rhythm of VA in CHF. We intent to explore the role of cardiac clock in sarcoplasmic reticulum RyR2 and arrhythmogenesis of failed hearts. Our results will provide novel insights into the mechanisms of "morning peak" in heart failure arrhythmias, and strongly support the chronotherapy of RyR inhibition in CHF.

慢性心力衰竭（CHF）患者易发生室性心律失常（VA）和心脏性猝死（SCD），并呈现明显昼夜节律，心脏内源性生物钟在其中发挥重要作用，但确切机制仍不清楚。我们前期研究发现心肌细胞的钙瞬变信号存在昼夜节律，而CHF小鼠行程序电刺激诱发的VA晨峰在特定时间应用RyR抑制剂丹曲林后消失。因此提出假说，心脏内源性生物钟核心因子Clock-Bmal1通过调控肌浆网RyR2参与心肌细胞内钙瞬变信号的调节，并参与慢性心衰VA昼夜节律的形成。本研究将通过构建心脏内源性生物钟核心因子Clock-Bmal1高/低表达病毒载体，并采用心肌细胞特异性Bmal1敲除小鼠，从分子、细胞及整体水平探索心脏内源性生物钟对肌浆网RyR2的调控作用及其机制，揭示慢性心衰VA晨间高发的原因，为CHF患者RyR抑制剂应用的时间治疗学提供有力的支持。

研究背景：. 室性心律失常（VA/SCD）的发作具有明显的昼夜节律特征，表明生物钟在其中发挥着重要作用。然而慢性心衰（CHF）时室性心律失常的发生是否有节律性，以及生物钟导致室性心律失常出现节律性的具体原因还尚未完全明确。心脏内源性生物钟可以影响心肌细胞内众多离子通道的表达及功能，然而关于生物钟是否可以影响2型兰尼碱受体（RYR2），最终导致室性心律失常的发作目前尚无研究。.研究内容：.（1）明确心脏内源性生物钟对肌浆网RyR2通道的开放是否具有调控作用；.（2）明确该调控作用是通过Clock-Bmal1对RyR2的直接调控还是通过β1-AR增加RyR2磷酸化来实现；.（3）明确CHF的VA/SCD发生的昼夜节律是否与不同时间RyR2表达/功能状态不同相关。.重要研究结果：.（1）小鼠心脏内源性生物钟及RYR2具有昼夜节律，敲除Bmal1后RYR2节律消失. 正常及心衰小鼠心肌组织中的内源性生物钟及RYR2存在昼夜节律（正常小鼠心肌各分子基因表达的节律模式，敲除Bmal1后，RYR2的节律消失。.（2）心衰小鼠VA/SCD发生具有节律性，敲除Bmal1或干扰RYR2后节律消失. 体外程序性电刺激的结果表明，在心衰小鼠离体心脏中，室性心律失常的诱发率具有时间差异性，当敲除心脏内源性生物钟后，上述时间差异性消失。同样，使用RYR2拮抗剂丹曲林后，心律失常的节律性消失。.（3）分离并体外培养原代心肌细胞内源性生物钟及RYR2的节律依然存在 . 完全去除中枢生物钟的影响后，心肌细胞内的内源性生物钟依然正常运转，RYR2也具有昼夜节律。.（4）Bmal11可以结合于RYR2的启动子，导致RYR2的转录翻译. ChIP的结果表明，Bmal1可以结合于RYR2启动子上的-1369bp位点。 双荧光素酶报告基因实验的结果表明，Bmal1可以结合于RYR2启动子，并启动RYR2的转录。.研究意义：. 本研究发现在心梗后心衰小鼠中，内源性生物钟核心节律因子Bmal1作为转录因子，可以结合于RYR2的启动子，并导致其转录翻译，从而直接调控RYR2的表达。本研究揭示了心衰时VA/SCD晨间高发的机制，为CHF时RYR2抑制剂应用的时间治疗学提供实验证据。