高寒草甸优质豆科牧草对UV-B增强的分子遗传学响应机制研究

大气臭氧层具有屏蔽太阳辐射中大部UV-B（289-320nm）的功能，防止地表生物受到伤害。人类使用氯氟烃(CFCs)，氯碳化合物(CCs)使大气臭氧层受到严重破坏，导致到达地表的UV-B辐射增强。植物如何应答UV-B以及应答的分子机制便受到了广泛的关注。青藏高原是我国长期的臭氧低值区。UV-B增强对高原地表植被尤其对优良牧草产生了重要影响。本项目拟以分布在高寒草甸的优良豆科牧草- - 歪头菜（Vicia Unijuga A.）为材料。用分子标记方法研究其遗传多态性现象及其与UV-B响应的关系；构建歪头菜cDNA文库，并克隆对增强UV-B辐射响应的基因，进行基因序列分析和功能研究，从而了解该牧草对UV-B响应的分子遗传机制。在此研究基础上进一步探讨如何有效发掘和利用特殊环境条件下的有利遗传资源，为高寒野生豆科牧草种质资源的发掘利用提供科学依据和技术支持。

本项目以野生歪头菜为材料，构建cDNA文库，并克隆木质素合成相关基因CCoAOMT和F5H；研究增强UV-B辐射下，其分子水平响应以及生理代谢和生长特性：采用RT-PCR法，研究了CCoAOMT，F5H和CAD基因在增强UV-B辐射下的表达特性，以及对木质素合成的影响；用Klason法测定了UV-B辐射下，木质素含量变化，并利用荧光和组织化学染色分析辐射下维管束细胞壁木质素沉积特性，并分析木质素合成变化与相关基因表达的关系以及与生长的关系；用HPLC法，研究了内源激素随UV-B辐射时间变化的特征及其与生长的关系；探讨了N、P元素代谢随辐射时间变化的特征及其与激素代谢和生长的关系。结果：构建的野生歪头菜全长cDNA文库滴度（titer）为6.2×109 pfu/mL， cDNA片段平均在1000bp以上，确保目的基因的调取；增强UV-B使CAD 和F5H表达下调、 CCoAOMT表达显著上调并可能是决定辐射下木质素合成的增加的重要基因之一；随UV-B辐射时间延长，木质素含量较对照明显增加，导致维管束木质素沉积增加，并加速了植株老化，生长减缓； UV-B辐射使长类激素水平和全氮含量在处理早期（10天）快速升高，然后降低，而植株生物量和株高增长量与生长类激素和全氮变化基本同步， 除了生长类激素对生长的影响外，UV-B辐射可能加速了植株氮素消耗并影响其生长。结论：成功构建野生歪头菜cDNA文库并克隆CCoAOMT和F5H基因为歪头菜功能基因组学研究、土著牧草改良、恢复草原生态、提高草地生产力，同时为挖掘优良遗传资源奠定基础；UV-B辐射增强可导致CAD和F5H基因表达下调，而CCoAOMT基因表达显著上调，结合木质素合成以及在维管束细胞沉积增加，表明CCoAOMT基因表达上调是UV-B辐射下木质素合成增加的重要因素；增强UV-B辐射初期，歪头菜生长类激素和全氮水平升高以及生物量和株高快速增加表明，一些来自青藏高原野生植物种经历长期强UV-B辐射环境，可能已形成了对增强UV-B辐射的应激响应机制，并能延缓其伤害；增强UV-B下，虽然歪头菜在初期应激性生长之后的生长抑制与生长素水平和氮素含量降低均有关系。但研究表明，增强UV-B下，生物量和株高增长量的减少与植株氮素水平降低有更紧密的联系；项目已经发表研究论文3篇，SCI收录1篇，资助硕士研究生4人，2人毕业并获硕士学位。