p38通过SUMO连接酶CBX4调控烧伤血管内皮细胞凋亡的分子机制研究

The leak of micro-vascular contents induced by endothelial barrier damage is the vital reason of complications like shock and organ dysfunction in severe thermal injury. Our study found p38-regulated endothelial cell apoptosis take part in this process, however, the underlying molecular mechanism still need further investigation. With proteomic method we found p38 interact with CBX4 in vitro and in vivo, and CBX4 is known as a SUMO E3 ligase and regulates endothelial cell transformation, cell proliferation, development and angiogenesis. In order to understand how do p38 regulate thermal injury induced endothelial apoptosis through CBX4, we will use protein kinase assay to investigate whether p38 activate CBX4 through phosphorylation. We will also use Tandem affinity purification associated Mass spectrometry to study if CBX4 regulate endothelial cell apoptosis through sumoylation of apoptosis related molecules. At last, we will prove the function of p38 and CBX4 in thermal injury induced endothelial cell apoptosis with CBX4 conditional knockout mice.

微血管内皮屏障破坏导致的血管内液漏出是重度烧伤患者发生烧伤休克、终末器官功能障碍等并发症的主要原因。本实验室发现炎症反应引起的内皮细胞凋亡是血管屏障功能损伤的原因之一，蛋白激酶p38介导了这一过程，但具体的分子机制仍不十分清楚。我们通过酵母双杂交发现CBX4可能是p38下游激酶。CBX4具有SUMO连接酶等功能，可通过SUMO化调控靶蛋白的活性和稳定性，参与细胞增殖、肿瘤发生、血管新生等重要生命活动的调控。为了明确p38是否通过Cbx4 SUMO化凋亡信号分子介导烧伤血管内皮细胞凋亡，我们将通过体外蛋白激酶实验验证p38是否通过磷酸化激酶CBX4的SUMO连接酶活性，结合串联亲和纯化耦联质谱技术鉴定CBX4调控的凋亡相关信号分子，最后利用CBX4条件性敲除小鼠和CBX4敲除细胞验证p38是否通过CBX4调控凋亡信号通路，完善烧伤诱导内皮细胞凋亡的细胞信号机制。

微血管内皮屏障破坏导致的血管内液漏出是重度烧伤患者发生烧伤休克、终末器官功能障碍等并发症的主要原因。本实验室发现炎症反应引起的内皮细胞凋亡是血管屏障功能损伤的原因之一，蛋白激酶p38参与介导了这一过程。我们进一步通过酵母双杂交发现CBX4可能是p38下游激酶。并通过激酶实验验证了p38 能够磷酸化CBX4，并通过构建位点突变体，证明了CBX4被p38磷酸化的位点是苏氨酸497位点。通过免疫共沉淀验证p38 通过磷酸化调节CBX4 功能，证明p38磷酸化CBX4蛋白后，可以协助CBX4募集其他蛋白形成转录抑制复合体。并通过免疫印迹技术证明该复合体中包括RING1、RB等转录抑制因子。通过流式细胞术证明了CBX4复合体对于细胞周期的调控作用，在骨肉瘤细胞表达CBX4突变体，证明p38磷酸化CBX4可以影响细胞周期调控蛋白CDC2的表达；通过报告基因系统证明CBX4复合体可结合到CDC2的启动子区域调控其转录；通过流式细胞术证明p38磷酸化CBX4后抑制了CDC2的表达，使得骨肉瘤细胞停滞在G2/M期。证明了CBX4调控细胞凋亡的分子机制，通过流式细胞分析内皮细胞凋亡水平，证明了CBX4被磷酸化后介导细胞周期阻滞，进而引起骨肉瘤细胞凋亡。