抗超级细菌卤代吩嗪类化合物作用靶点及抗菌机制的研究

In recent years, bacterial resistance problems are getting worse and worse, which seriously threatens the public health. The emergence of superbugs forced us to accelerate the pace of research and development of new antibiotics. The discovery of novel antibacterial targets is the key to the development of new drugs. We have recently discovered a series of potent antimicrobial agents called halogenated phenazines (HP) that show a high anti-bacterial effect (at the nM level) on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and a variety of clinical drug-resistant bacteria in both planktonic and biofilm states. However, the target molecules and antibacterial mechanisms of these phenazine antibiotics are unknown. In this proposal, utilizing planktonic and biofilm MRSA as the target organisms, we intend to identify the target of HP compound and study the anti-bacterial/anti-biofilm mechanisms by the affinity capture-mass spectrometry, RNA-seq, drug-resistant mutants-reference mapping, and CRISPR/Cas9 based gene knockout/knockdown. New information gained from the currently proposed studies will facilitate future antibiotic discovery efforts.

近年来细菌耐药性问题严重威胁到公众健康，超级细菌的出现更迫使我们加快对新型抗菌素的研发速度，而发现新颖的抗菌靶标则是新药开发的关键。最近，我们发现了一类对多种临床耐药菌均具有抗菌活性的卤代吩嗪类化合物（HP）。HP化合物在纳摩尔级便对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）具有杀菌作用，并可清除MRSA及多种临床耐药菌所形成的生物被膜。我们的前期结果显示HP具有新颖的抗菌机制，对生物膜内细菌同样具杀菌活性，但其具体作用靶点和作用机理尚未知。本项目，我们将分别以浮游状态和生物膜状态的MRSA为研究对象，通过亲和捕获-质谱鉴定、转录组、耐药突变株-重测序、基于CRISPR/Cas9的基因敲除/敲低等多种技术手段，鉴定HP化合物的抗菌靶标，阐明其抗菌/抗生物膜机理，预判细菌对该类抗生素可能的耐药性产生机制，为新型抗菌素的研发提供新的靶标和研究策略。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）往往是囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）患者肺部的最初定植者，而后被铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）取代成为CF患者肺部主要的病原体。在这个生态位中，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的关系被认为是竞争的，而不是合作的。铜绿假单胞菌可以通过产生吩嗪化合物抑制金黄色葡萄球菌的生长，如吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA)和绿脓素(pyocyanin, PYO)。其中，PYO是一种关键的抗菌化合物，在宿主环境内能够抑制金黄色葡萄球菌的呼吸作用，升高其胞内活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）的水平，从而起到抑制金黄色葡萄球菌的作用。金黄色葡萄球菌在其呼吸链相关基因，如孟醌生物合成基因menB、血红素生物合成基因hemB、两种末端氧化酶基因cydB-qoxB突变的情况下，会进化出小菌落特征并对PYO具有抗性。然而，目前尚不清楚在不牺牲自身呼吸作用的情况下金黄色葡萄球菌是否存在其他吩嗪耐受机制。.最近，由合作者Huigens实验室合成的一系列卤代吩嗪抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）有很强的杀菌活性。HP-22是其中最有效的抗生素之一，其最低抑菌浓度（MIC）为0.04 μg/mL，相较于PYO（MIC为14 μg/mL）是更为有效的吩嗪抗生素。本研究使用HP-22作为筛选压力对MRSA MW2菌株进行连续传代培养，经过一周的连续传代筛选到3株HP-22耐药突变株，其MIC升高64-128倍。利用Illumina MiSeq技术对3株HP-22耐药突变菌株进行了全基因组测序和比较基因组分析。发现3个耐药株均在tetR21基因（MW2297）的346位点发生了一个共同的单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV)，导致TetR21蛋白中116位精氨酸变为半胱氨酸（R116C）。TetR21属于TetR家族转录因子，该家族转录抑制子通常形成同源二聚体，通过结合靶基因启动子区的调控DNA（tetO）抑制靶基因的转录。已知在金黄色葡萄球菌中TetR21负调控四环素外排泵Tet38和