多发性硬化抗原特异性CD4+CD25+调节性T细胞的体外扩增及其治疗潜能的研究

针对多发性硬化（MS）患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的免疫功能缺陷，尝试利用体外培养法获取功能正常的Treg并评估其治疗潜能。本课题以经CD40激活的B细胞作为抗原提呈细胞，在体外与MS患者外周血CD4+初始T细胞共同培养，以诱导并扩增髓鞘碱性蛋白（MBP）85-99特异性CD4+CD25+ Treg，经细胞分离和表型鉴定后，检测所获Treg的免疫抑制功能、细胞因子表达以及凋亡程度等活性；为进一步验证经此法所扩增的抗原特异性Treg的功能活性，以同样方法自健康小鼠获取MBP85-99特异性CD4+CD25+ Treg，然后过继转移于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）鼠体内，观察该Treg转移对EAE病情和病理学改变的影响。本课题提出了一种全新的免疫调节策略，为今后开展长期的MS特异性治疗提供了新思路。

以往研究发现多发性硬化（MS）患者存在CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的免疫抑制功能缺陷，因而如何获得功能正常的Treg是当前MS治疗研究的热点问题之一，本研究通过密度梯度离心法获得MS和健康对照外周血单个核细胞（PBMC），利用磁珠分选经阴性选择获得纯化率高达90%的B细胞，通过体外培养在含有可溶性CD40配体（sCD40L）、白细胞介素（IL）-4的培养液活化，并经髓鞘碱性蛋白（MBP）85-99肽段特异性刺激以制备抗原提呈细胞。此外，同期利用免疫磁珠阴性选择获得纯化率高达80.62%的初始T细胞，将其与该活化的B细胞共培养，并加入雷帕霉素、4-1BB、MBP85-99刺激初始T细胞的增殖与转化，培养6d后获得3.5~11.9%的MBP抗原特异性Treg。利用荧光染料CFSE标记的初始T细胞可测及传代，通过SYBR Green 定量PCR方法测定Treg bim、bcl-2、bcl-xl等凋亡分子及4-1BB、Foxp3等功能相关分子的mRNA表达，并将Treg与荧光染料CFSE标记的初始T细胞共培养，以检测其对初始T细胞增殖抑制程度及相应上清液中IL-4、IL-10、干扰素（IFN）-γ、转化生长因子（TGF）-β水平。初步结果表明：CD40L活化的B细胞可作为抗原提呈细胞，在体外诱导MS患者外周血CD4+初始T细胞扩增获得抗原特异性CD4+CD25+ Treg，该Treg具有良好的免疫调节功能，进而证实本方法能够在体外扩增并转化出具有正常功能的抗原特异性Treg，为今后开展MS患者Treg的免疫调节治疗提供可靠的证据。