EGFR调控脓毒症中巨噬细胞发生Parthanatos的分子机制研究

Our previous publication reported that EGFR plays a critical role in regulating the production of inflammatory mediators in sepsis. However, up to now, there is no study concerning about whether EGFR also regulates the death of cells in sepsis. Parthanatos is a new defined type of ROS or DNA damage related cell death in recent years, which is characterized by PARP over activation, PAR accumulation and AIF nuclear translocation. So far, Whether and how parthanatos occurs in sepsis is still remianed unknown. Our previous experiments revealed that both in vitro LPS treatment and in vivo CLP model, we observed PARP activation, PAR accumulation, and AIF nuclear translocation in macrophages 12 hrs after treatment and these phenomena could be inhibited by EGFR inhibitor erlotinib. All these results indicated that the macrophages endure a process of parthanatos in sepsis and this kind of cell death needs the help of EGFR activation. Therefore, through this study, we need to address these following questions: 1. What is the percentage of parthanatos in septic-related cell death and how does it occured? 2. How does EGFR play a role in controlling the occurrence of parthanatos? 3. What is the prospect of blocking the process of parthanatos in the treatment of sepsis?

我们已发表的工作证实EGFR对脓毒症中炎症因子的释放发挥了重要调控作用，但EGFR是否还会影响脓毒症中细胞的死亡方式，目前这方面的研究还是空白。Parthanatos是近年来发现的一种与ROS和DNA损伤相关的死亡方式，其特点表现为PARP激活、PAR在细胞内聚集及AIF入核。目前，有关Parthannatos在脓毒症中的发生情况还不清楚。但我们发现无论是体外LPS刺激，还是体内CLP模型，都能诱导巨噬细胞PARP激活、PAR聚集以及AIF入核，且这些效应能够被EGFR抑制剂Erlotinib抑制。提示脓毒症中，巨噬细胞发生了Parthannatos，而且这种死亡形式是受EGFR调控的。因此本研究旨在进一步探讨：1.脓毒症中Parthanatos在死亡细胞中所占比例，及其发生机制？2.EGFR参与调控Parthannatos的分子机制？3.抑制Parthanatos对脓毒症的治疗前景如何？

多种细胞死亡方式在脓毒血症或者内毒素血症模型中都能见到，如细胞凋亡（apoptosis），坏死（necrosis），焦亡（pyroptosis）等。但是与氧化应激以及氧自由基密切相关的死亡方式Parthanatos在脓毒症中缺很少有报道，而脓毒症中都会伴随有大量的氧自由基产生，和DNA损伤，这些都是诱发Parthanatos的病理生理基础。在本项国家自然科学基金资助下，我们发现脓毒症中EGFR的磷酸化可以调控下游Rab5a蛋白的活性，进而促进TLR4从高尔基体转运到细胞膜表面并识别LPS参与炎症信号放大。激活以后的TLR4可以通过下游PI3K/AKT-ERK1/2通路促进氧自由基ROS的产生，并造成DNA损伤，进而诱发Parthnatos的发生。使用EGFR抑制剂不仅能够减少由LPS/TLR4通路诱发的氧自由基爆发还能显著降低TNF-、IL-1等炎症因子的产生，进而减少parthanatos的发生。同时EGFR的内源性体调控因子Mig-6也能够通过调控EGFR二聚体的形成进而影响parthanatos的发生。抑制了parthanatos的发生以后，脓毒症中其他死亡方式如坏死和焦亡也会相应减少。我们还发现参与parthanatos的Ca2+来自内质网，并非线粒体。异丙酚能够反转parthanatos中内质网Ca2+的减少，内质网Ca2+释放后，能够积聚在线粒体中，导致线粒体Ca2+超载，而采用异丙酚后，线粒体中Ca2+的浓度显著下降，说明异丙酚能够减少内质网Ca2+的释放，进而减少线粒体Ca2+超载，从而保护线粒体的稳定。parthanatos死亡能够产生许多危险分子，其中HMGB1是内毒素血症中常见的细胞外释放的危险因子。HMGB1不仅在细胞质和细胞膜上增加了RAGE的表达，而且还上调了TLR4在质膜上的表达。敲除RAGE可导致MAPKs活化、细胞膜TLR4表达及相应的炎性细胞因子产生减少。同时，抑制MAPKs激活也降低了TLR4的表面表达。表明HMGB1可能与细胞表面的RAGE受体结合，导致MAPKs活化，从而促进TLR4在细胞表面的易位，但不调节其转录和翻译。另一方面，TLR4能增加RAGE的转录和翻译，使其易位到细胞表面结合更多的HMGB1。TLR4和RAGE都与细胞表面的HMGB1结合，导致炎性细胞因子的转录和分泌。这些结果表明，RAGE和TLR4之间的