牛11号染色体上免疫球蛋白重链位点独特的基因结构及多样性机制

Immunoglobulins (Igs) are essential molecules for the animal adaptive immune response. The cattle is the first species in mammals that harbors two immunoglobulin heavy chain (IgH) gene loci in different chromosomes. The genomic organization of the IgH locus in BTA21 has already been elucidated，but few researches have been focused on the IgH loci in BTA11. Although previous studies indicated that the IgH locus in BTA11 only contained a pseudo μ gene, our recent analysis of a BAC sequence covering this region demonstrated at least a functional μ gene and a pseudo δ gene. Whether there are other types of constant region genes remain unclear, as well as the germline orgnization and diversity of the V,D and J gene segments. Based on the previously study about the genomic organization and expression of all three light chain gene loci in Xenopus tropicalis, the applicant will characterize the cattle IgH gene organization in detail by BAC library screening, sequencing and bioinformatics analysis. Moreover, cattle-specific characters about VDJ recombination, somatic hypermutation (SHM) and gene conversion (GC) are going to be analysed in order to illuminte the mechanism utilized to generate the variable region diversity in cattle.

免疫球蛋白（Ig）是动物适应性免疫系统的重要效应分子。牛是目前所知的哺乳动物中唯一具有两个免疫球蛋白重链（IgH）基因位点的动物。位于21号染色体上的IgH基因结构已经清晰，但11号染色体上重链的位点结构仍未见报道。申请人最近对一个覆盖11号染色体IgH恒定区BAC的测序结果表明，该位点除了包含一个有功能的Cμ基因外，还存在一个Cδ假基因，是否存在其它类型的恒定区基因，以及该位点上V、D、J基因片段的分布和重组机制仍不清楚。本申请项目在申请人对两栖类动物免疫球蛋白轻链类型、结构和重组特点研究工作基础上，拟通过牛全基因组BAC 文库筛选、测序和生物信息学方法获得牛11号染色体上IgH位点完整的物理图谱；并利用表达序列的克隆、比对和分析阐明牛IgH可变区 VDJ重组、体细胞高突变（SHM）和基因转换（GC）的特点，从而揭示牛Ig多样性的分子机制，为更深入地了解牛的抗病机理提供理论基础。

牛免疫球蛋白重链（IgH）具有独特的基因结构，然而对其IgH基因位点的详细结构及多样性形成的机制尚未见报道。本研究首先通过Southern杂交方法对荷斯坦奶牛RP42-BAC 文库进行筛选并获得了30 个包含牛IgH的 BAC克隆。利用荧光原位杂交（FISH）技术确定牛基因组中只存在一个IgH基因位点并位于21号染色体上，而在11号染色体上不存在有功能的重链基因位点。基于对 7 个 BAC 克隆的全长测序和长片段 PCR 实验，我们获得了包括部分V 区在内的免疫球蛋白重链基因位点结构信息：5ʹ-VHn-DHn-JHn-μ1-(ψδ-ψV-DHn)3-JHn-μ2-δ-γ3-γ1-γ2-ε-α-3ʹ。利用生物信息学软件，构建了较为完整的IgH物理图谱。通过Fuzznuc在线软件分析，在长约 284 kb 的部分 V 区序列中仅发现了12个有功能的 VH 基因片段，系统发生分析表明它们属于同一家族且具有很高的同源性（＞89%）。在4个DH 位点中共发现23个DH片段，16 个具有重组功能，其中有一个超长的 DH 片段，其编码长度达到 149 bp。VDJ 重组分析证明 IgM1 和 IgM2 对于 DH、JH 片段的使用都有着极强的偏好性，这大大限制了VDJ重组的多样性。推测牛主要通过增加连接多样性程度和CDR3H 平均长度来弥补因为可变区基因片段数目有限造成的 VDJ 重组多样性的不足。本研究揭示了牛免疫球蛋白重链基因的多样性产生机制，填补了家养动物免疫遗传学研究的空缺，也为更深入地了解牛的抗病机理提供理论基础。