RIP1-ROS通路介导的自噬激活对视网膜脱离中光感受器细胞坏死性凋亡的作用及调控机制研究

Our previous study found，z-VAD-FMK ( pan- caspase inhibitor ) intervention induced photoreceptor necroptosis after retinal detachment, accompanied by significant autophagy activation. To the best of our knowledge, autophagy activation plays a protective role in regulating photoreceptor apoptosis . But it is not clear , the activated mechanism of autophagy in photoreceptor necroptosis and whether autophagy can down regulated necroptosis. Based on these above findings , this study explore the RIP1-ROS pathway mediated autophagy activation and further clarify the down regulation of necroptosis induced by autophagy in experimental retinal detachment， based on z-VAD-FMK intervention and the further application of 3-MA and rapamycin intervention.The outcome of this study will demonstrate the activated mechanism of autophagy and down regulation of necroptosis induced by autophagy; further enrich the relationship among apoptosis、autophagy and necroptosis; improve retinal cell damage / repair molecular mechanisms , which may be used as a therapeutic strategy for preventing vision deficit in various retinal disorders associated with photoreceptor loss.

本课题组前期研究发现视网膜脱离后，z-VAD-FMK（泛caspase酶抑制剂）干预，可以导致光感受器细胞坏死性凋亡（Necroptosis）的发生，同时伴有明显的自噬（Autophagy）激活。目前已知，自噬激活可以部分抑制光感受器细胞的凋亡，保护视网膜细胞。但是目前尚不清楚，坏死性凋亡中自噬的发生机制及其是否对坏死性凋亡也有抑制作用。本课题组将以这些发现为基础，通过视网膜脱离模型的建立，在z-VAD-FMK干预的基础上，进一步应用3-MA和雷帕霉素干预，检测坏死性凋亡和自噬通路相关蛋白的表达，明确RIP1-ROS通路对光感受器细胞坏死性凋亡中自噬的激活作用，并且进一步阐明自噬激活对坏死性凋亡的抑制作用。研究成果对于丰富自噬、凋亡和坏死性凋亡之间的调控关系，完善视网膜细胞损伤/修复分子机制，保护和恢复患者残存视功能有着重要临床意义。

视网膜脱离（retinal detachment, RD），是指视网膜色素上皮层及神经感觉层之间的分离。尽管视网膜脱离手术治疗已取得重大进展，但患者视力恢复不佳，主要与视网膜脱离后光感受器细胞的死亡有关，但其死亡机制尚未完全明了。z-VAD-FMK（泛caspase酶抑制剂）干预，不仅可以使细胞坏死性凋亡（Necroptosis）增加，并且同时伴有明显的自噬（Autophagy）激活，Necrostatin-1（坏死性凋亡特异性抑制剂）干预后，在抑制坏死性凋亡发生的同时，还可以部分抑制细胞自噬。但不知，坏死性凋亡中自噬的激活机制以及自噬对坏死性凋亡的调控作用。本课题组以此发现为基础，建立SD大鼠视网膜脱离模型。设立1.attached组 2.untreated组 3.z-VAD-FMK组 4.Necrostatin-1+z-VAD-FMK组，结果发现z-VAD-FMK干预使视网膜光感受器细胞发生坏死性凋亡的同时，ROS的表达增加 ；Necrostatin-1干预可以使ROS的表达减少；进一步检测parp-1蛋白，z-VAD-FMK干预，使光感受器细胞坏死性凋亡发生的同时 ，parp-1蛋白表达增加（0.21±0.03），而Necrostatin-1联合干预可以抑制PARP-1蛋白的增加（0.09±0.02）。该结果证明光感受器细胞可能是通过RIP-1—ROS--PARP-1通路激活自噬的；在此基础上，再通过3-MA干预（抑制自噬）和雷帕霉素干预（促进自噬），设立1.attached组 2.untreated组 3.z-VAD-FMK组 4.z-VAD-FMK+3-MA/雷帕霉素组。研究发现3-MA干预后ROS及光感受器细胞死亡并未有明显减少，可见自噬并不是坏死性凋亡中促死亡因素。雷帕霉素干预后，自噬相关蛋白表达增加，而坏死性凋亡相关蛋白受抑制。电镜检测雷帕霉素干预后细胞死亡也明显减少。综上所诉，视网膜脱离后，光感受器细胞自噬激活对坏死性凋亡有一定的抑制作用和对光感受器细胞存活的保护作用。