有氧耐力相关功能型分子标记生物学活性研究

用基因克隆、定点突变、基因重组、细胞转染等分子生物学方法对本研究团队在前期研究中所发现的与中国人有氧耐力相关联的功能型分子标记进行生物学活性研究。通过研究携带不同等位基因的目的片段对基因表达的影响，探讨其与有氧耐力关联的机制，为进一步确定有氧耐力相关功能型分子标记作为运动员基因选材位点提供分子生物学实验依据。同时，通过对功能型分子标记生物学活性的研究，探索有氧耐力受遗传影响的分子机制。

本项目以基因克隆、定点突变、基因重组等分子生物学方法为基本手段，结合不同位点在基因组中所处的位置特点，利用不同的生物学方法，对本课题组在前期研究中筛选到的17个与有氧耐力相关联的分子标记的生物学功能进行研究。主要成果如下：1. 核基因编码区：经生物信息学分析和圆二色谱仪测定，TF基因P589S位点、TFR基因A/424G位点变异均可使其编码的蛋白质二级结构和蛋白表面性质发生改变；经全细胞膜片钳分析，KCNJ11基因E23K多态可显著改变细胞膜表面电流密度，从而改变离子通道功能；实时定量PCR检测显示，AGT1R基因rs5182位点变异不影响其mRNA的表达水平；经放免法检测，EDNI基因rs5370位点变异对细胞培养液中目的蛋白表达没有产生显著性影响。2. 核基因内含子区：双荧光素酶报告基因检测结果显示，LPL基因rs283、CEPT基因TaqIB位点变异均能使报告基因的表达活性发生显著性改变；在微基因表达载体中，ACE基因I/D多态致目的基因mRNA表达水平显著性变化。3. 核基因调控区：经双荧光素酶报告基因系统检测，Glut4基因启动子区rs5418位点、EPO基因增强子区rs551238位点变异均能使报告基因的表达活性发生显著性改变。4. 线粒体非编码区：双荧光素酶报告基因检测，携带mt235A、mt514-515CA、mt16183A和mt16319G的载体基因表达量显著高于mt235G、mt514-515（Del）、mt16183C和mt16319A（p<0.01）。携带mt16290位点的两种质粒对报告基因相对活性的影响没有差异。5. 线粒体编码区：体内检测和体外蛋白表达结果显示，ATP6基因mt8794位点变异对其所在人体蛋白表达有影响，对体外表达体系中mRNA的转录水平有极显著影响。而ND5基因mt12338位点变异对蛋白表达的影响不大。以上研究结果从分子遗传学、蛋白功能学、蛋白表达调控等多方面为揭示相关分子标记影响有氧耐力的机制提供了实验依据。