抑制STAT3上调自噬减轻衰老心肌缺血再灌注损伤的机制研究

The aging myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury is an significant cause of heart failure after cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Recently it was reported that autophagy plays an important role in protection against myocardial IR injury. Down-regulation of autophagy, existing in aging cardiomyocte, could aggravate myocardial IR injury, while up-regulation of autophagy by preconditioning could attenuate IR injury. Inhibition of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3), which attenuates myocardial IR injury we had reported previously, can induce augementation of autophagy. Analysis of the promoters of the core autophagy genes uncovered that there was a consensus Stat3 site in the promoter of Atg3, a key gene for autophagy. Therefore we speculate that inhibition of STAT3 should enhance autophagy to attenuate myocardial ischemia/reperfusion injury via Atg3. To test the hypothesis, cardiac function, myocardial apoptosis and mitochondrial function following inhibition of STAT3 under low autophagic activity would be evaluated in the ischemia/reperfusion rat heart model and cardiomyocte model. Then, we will detect autophagosomes formation, expression of Atg3 gene and autophagy-related proteins LC3Ⅱ, Beclin1 following inhibition of STAT3. Finally, to elucidate the mechanism of autophagy up-regulation through inhibition of STAT3, we will explore STAT3` action on promoter of Atg3 gene using DNA mobility shift assay, chromatin immunoprecipitation assay and foot-printing assay. The research would clarify the mechanism of aging myocardial ischemia/reperfusion injury from a new perspective, and provide a new approach for its treatment.

衰老心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，IR）损伤是体外循环心脏手术后发生心衰的重要原因之一。近年发现衰老心肌自噬水平下降是加重IR损伤的重要因素，上调自噬能减轻IR损伤。STAT3在自噬调节中发挥重要作用；前期我们证实抑制STAT3能减轻心肌IR损伤，且自噬相关基因Atg3启动子区域存在STAT3结合位点。因此设想：抑制STAT3能减轻衰老心肌IR损伤，可能是通过Atg3来上调自噬的结果。本课题将在器官和细胞两个水平复制IR模型，观察低自噬条件下抑制STAT3对IR损伤的影响；检测抑制STAT3对心肌自噬体形成、Atg3基因表达、自噬体蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达的影响。并通过DNA迁移率变动实验、染色质免疫共沉淀、足迹实验等研究STAT3与Atg3间的作用，探讨抑制STAT3上调自噬的机制。本课题将从新的视角阐明衰老心肌IR损伤的机制，为其防治提供新思路。

心肌缺血再灌注损伤是体外循环心脏手术后发生心功能衰竭的重要原因之一。自噬在心肌缺血再灌注损伤中具有重要的意义，而STAT3 在自噬调节中发挥重要作用。前期我们的预实验证实抑制STAT3 可能减轻心肌损伤，但其具体作用机制是否与自噬相关尚不明确。在本研究中，我们首先比较了不同海拔区域人群体外循环术后心肌缺血再灌注损伤程度，并分析了其与基础心肌自噬间的关系。从心损标志物cTnI、脑钠肽BNP、组织损伤评分和心肌细胞凋亡率等比较两组心肌损伤差异；并进一步分析了LC3II、Beclin1、LAMP2等自噬相关蛋白及其与低氧相关的上游蛋白Bnip3。发现高原组患者cTnI峰值以及BNP最大增长倍数显著低于平原组（分别为3.10 ± 0.77 vs 7.10 ± 2.28 ng/mL和2.51 ± 0.94 vs 14.66 ± 6.83）。高原组自噬相关标志物LC3II和LAMP2，以及Bnip3在缺血前、缺血再灌注后均显著高于平原组；而Beclin1在两组之间无差异。因此高原患者体外循环心肌缺血再灌注损伤程度轻于平原患者，其机制可能与较高的基础自噬水平有关。其次，我们在离体心脏灌注模型中研究了抑制STAT3对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。根据预处理措施分为4组：缺血预处理组、AG490组、Rapamycin组和对照组。记录左室发展压、Max Dp/dt和Min Dp/dt等血液动力学参数；分析心肌细胞凋亡率以及STAT3、p-STAT、LC3和LAMP2蛋白表达。结果显示三种预处理心脏功能优于对照组；AG490预处理组Max Dp/dt和Min Dp/dt显著高于Rapamycin组；AG490预处理组Max Dp/dt和Min Dp/dt与缺血预处理组间无显著差异。AG490预处理组心肌细胞凋亡率低于对照组，但和缺血预处理、Rapamycin预处理组无显著差异。AG490预处理组STAT3磷酸化水平显著低于其他预处理组；但其LC3水平与两组预处理组相似，LAMP2水平低于另外两预处理组。因此，AG490预处理组，抑制STAT3磷酸化，但能上调自噬，减轻心肌缺血再灌注损伤。综上所述，本研究从临床研究、离体心脏灌注模型等多个层面证实了心肌缺血再灌注损伤受自噬水平影响；抑制STAT3能减轻心肌缺血再灌注损伤，其机制并非通过经典的STAT3途径，很可能与其提高心肌自噬水平有关。