多功能核-膜型siRNA传递系统的设计及其提高siRNA细胞转染效率和抑制肿瘤微血管生成的研究

本项目拟解决目前siRNA转染效率低，体内稳定性差等问题，结合阳离子脂质和阳离子聚合物的特点，构建内水相为磷酸钙-siRNA纳米粒，外层包裹聚阳离子脂质体的新型核-膜型复合载体。通过脂质体包裹技术控制磷酸钙纳米粒的粒径，并对脂质体表面进行阳离子聚合物和功能性组分修饰，增加复合载体的细胞摄取和内体逃逸能力，提高siRNA的基因沉默效率。研究该复合载体的细胞摄取和胞内转运，阐明载体结构和各功能性组分对siRNA细胞内分布的影响，实现控制siRNA在胞内特定区域的释放。考察该载体携载VEGF-siRNA的基因沉默和体内肿瘤微血管生成抑制作用，阐明制剂因素对siRNA基因沉默作用的影响，从而进一步指导siRNA载体的设计。本项目研究将为非病毒siRNA载体的设计提供新的思路和方法学基础，具有重要的应用前景。

本项目构建了以磷酸钙-siRNA纳米粒为内水相，外层包裹聚阳离子脂质体的新型核-膜型复合载体，并对其制备工艺、性质、细胞毒性、细胞摄取、胞内动力学和体外转染效率进行了考察，研究了该载体携载GFP-siRNA和VEGF-siRNA后在肿瘤细胞内的基因沉默作用。本项目以不同分子量的聚乙烯亚胺和胆固醇甲酰氯为原料合成PEI-Chol，用于修饰脂质体，形成表面带正电荷的聚阳离子脂质体，有利于携载水溶性负电荷的siRNA进入细胞。采用反相微乳法和共沉淀法制备得到粒径均一、稳定性较好的磷酸钙纳米粒，在此基础上进一步以聚阳离子脂质体包裹纳米粒溶液，得到聚阳离子脂质体／磷酸钙纳米粒复合载体。复合载体外层聚阳离子脂质体减少了磷酸钙纳米粒之间的聚集，提高了转运过程的稳定性，增加其胞内的滞留时间；而内水相的磷酸钙纳米粒能够促进siRNA在胞浆内的释放，初步实现siRNA在细胞内特定区域的控制释放。复合载体对特定基因mRNA水平的沉默效率和蛋白表达的抑制作用不仅明显优于单用纳米粒或聚阳离子脂质体，而且也高于Lipofectamine 2000。本项目的研究为非病毒siRNA载体设计提供了新的思路和实验基础。