基于连续定向进化的柚皮素工程菌调控机制研究

Due to the significant physiological functions, flavonoids have been extensively used in pharmaceutical and food industries. (2S)-Naringenin as flavonoids scaffold can be modified to lots of high added-value flavonoids. Although lots of outstanding results have been achieved by the microbial synthetic method, the (2S)-naringenin titer still cannot be further improved by conventional metabolic engineering strategies, since the lack of understanding of the mechanism of (2S)-naringenin intracellular synthesis and transport. In the current project, (2S)-naringenin responded proteins and aptamer would be used to establish intracellular and extracellular biosensors, respectively. Based on the established biosensors, continuous directed evolution strategy would be established by combining the flow cytometry and Ori101 (temperature sensitive replication origin) to enhance the intracellular synthesis and transport of (2S)-naringenin. Last but not least, we would further explore the potential rate-limiting steps by comparative genomics and transcriptomics. The results obtained from current project could provide theoretical and technical references for the other flavonoids biosynthesis.

黄酮类化合物具有众多的生理功效,在医药和食品等领域具有广泛应用。柚皮素是一种具有最多黄酮衍生物的骨架物质，通过对柚皮素的后续修饰可形成众多具有更高附加值的黄酮类化合物。虽然微生物法合成柚皮素已经取得了显著的进展，然而由于缺少对柚皮素的合成和转运机制的理解，难以利用常规代谢工程手段进一步提高产量。本项目基于可与柚皮素响应的调控蛋白和适配体分别构建胞内和胞外生物传感器，结合流式细胞仪分选技术和温敏型复制起点Ori101建立大肠杆菌连续定向进化系统，强化柚皮素的胞内合成和跨膜转运。并通过比较基因组学和转录组学技术深入挖掘全局代谢网络中潜在的重要代谢节点，为其他黄酮类化合物的微生物法合成提供理论和技术参考。

柚皮素具有抗氧化、抗病毒和预防肿瘤等多种生理功效，在食品和药品中有广泛应用。此外，柚皮素是黄酮类化合物的核心骨架物质，通过化学或生物催化后可形成其他种类众多、功能多样、附加值更高的黄酮类化合物。目前，微生物法合成柚皮素产量较低，无法满足工业化生产。这主要是因为柚皮素合成途径代谢流不均衡、与底盘细胞不适配等因素造成的。通过定向进化策略进行柚皮素细胞工厂的系统优化，将可以有效解决这一难题。为此，本项目1) 以FdeR、TtgR和PadR转录因子为基础，通过启动子优化获得了低背景、高动态范围的柚皮素和对香豆酸生物传感器；2) 以TtgR传感器和金属离子与柚皮素的颜色反应为基础，结合流式细胞仪分选技术，建立了2种柚皮素高产菌的高通量筛选方法，并通过定向进化方法平衡了柚皮素合成途径；3)发现柚皮素合成的重要代谢节点是acpH、acpS、acpT、ACC和acs；4) 以FdeR和PadR生物传感器为关键节点基因表达的控制中枢，建立了三层、单细胞水平的动态调控系统，并以定向进化方式优化了其表达水平，实现了柚皮素合成和细胞生长的动态平衡；5) 系统优化了柚皮素合成的培养基成分和发酵条件，柚皮素产量达到588 mg/L。在项目研究中所建立的生物传感器、定向进化方法和动态调控方法将为其他黄酮类化合物的微生物生产提供理论和技术参考。