OGT亚型底物蛋白组学方法建立及在乳腺癌研究中的应用

O-GlcNAcylation takes part in variant cellular physiological processes. It is closely related to some diseases such as cancer and diabetes. This modification is predominantly regulated by a pair of enzymes:N-acetylglucosamine transferase (OGT) O-GlcNAcase (OGA). Human cells contain three subtypes of OGT. sOGT and ncOGT distribute in cytoplasm and nucleus, while mOGT locates in mitochondria. we found that sOGT and ncOGT have different substrates in some cells (such as HEK293T cells) and they can use different sugar donors. In this project, we will develop some specific sugar probes via the screen of a panel of sugar donors, and establish a proteomic method used to detect substrate proteins of different OGT subtypes. By appling this method in breast cancer research, we wish to disclose substrate proteins of different OGT subtypes and how is O-GlcNAcylation related to breast tumor growth and metastasis. The established method would help investigate substrate proteins of different OGT subtypes in various cells. Its application in breast cancer research would further our understanding of the channel for different protein O-GlcNAcylation, and their influence on tumor growth and metastasis. The result will contribute to pathylogical study of breast cancer as well as their therapy.

蛋白乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc修饰)参与多种细胞生理过程，与肿瘤、糖尿病等多种疾病密切相关。该修饰主要由N-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT）、糖苷酶（OGA）协同调节完成。人类细胞中有三种不同OGT亚型，其中sOGT与ncOGT存在于细胞质、细胞核中，mOGT定位于线粒体内。我们发现某些细胞中sOGT与ncOGT底物蛋白显著不同，而且它们能利用不同糖供体。 本课题拟通过糖供体筛选开发两种糖探针，制备其抗体，建立OGT亚型底物蛋白研究方法；应用该方法研究乳腺癌细胞中不同OGT亚型底物蛋白，并研究特定蛋白糖基化与肿瘤生长、转移之间的关系。 该方法建立有助于从组学水平高通量分析细胞中不同OGT亚型底物蛋白；其在乳腺癌研究中的应用有助于深入了解乳腺癌细胞中蛋白O-GlcNAc修饰途径，了解特定蛋白糖基化对乳腺癌生长、转移的影响，为乳腺癌病理研究及相关治疗提供理论依据

研究背景：蛋白O-GlcNAc修饰参与多种细胞生理过程，与肿瘤、糖尿病等多种疾病密切相关。细胞内蛋白O-GlcNAc修饰由OGT、OGA协同调节完成。人类细胞中有三种不同OGT亚型，其中sOGT与ncOGT存在于细胞质、细胞核中，mOGT定位于线粒体内。我们发现某些细胞中sOGT与ncOGT底物蛋白显著不同，而且它们能利用不同糖供体。为此，本项目提出以不同糖供体作为糖探针，研究细胞内不同OGT亚型底物蛋白差异的构想。.研究内容与结果：通过项目研究确定了一种针对sOGT的代谢标记探针GlcNPh（尚未发表）；通过OGT结构改造提高了通用探针GlcNAz的代谢标记效率；发展了一套基于OGA突变体的O-GlcNAc修饰蛋白富集方法（尚未发表）；通过蛋白组学方法发现sOGT与ncOGT底物蛋白差异显著（> 200种），相对于sOGT ，ncOGT表达能明显促进HEK293T细胞增殖（尚未发表）；发现导管乳腺癌腋窝淋巴结转移相关差异O-GlcNAc修饰蛋白，其中部分蛋白参与肿瘤生长和转移过程；发现OGT可通过caspase-3途径降解泛素化E3连接酶NEDD4-1;　发现了HNF1A介导的OGT转录调控负反馈模式（尚未发表）及OGT自身糖基化（T12A/S56A）对其底物识别和细胞内功能的影响（尚未发表）；建立了细胞内O-GlcNAc修饰双荧光报告系统，方便实时检测细胞内糖基化变化（尚未发表）。通过本项目研究，已发表论文6篇(含接受１篇)，待发表论文＞３篇。.科学意义：项目研究所建立的双荧光报告系统、代谢标记方法和蛋白富集方法将有助于了解细胞内O-GlcNAc修饰动态变化及后续蛋白质组学研究，了解该修饰在生理、病理情况下的作用机制。另外，转录和翻译后翻译修饰水平研究结果揭示了OGT调控机制，提高了我们对O-GlcNAc修饰相关调节机制的认识水平。