高原缺氧大鼠肠上皮细胞损伤的自噬调控效应及其分子机制

The damage of intestinal epithelium and intestinal mucosal barrier can led to multiple organ dysfunction. The autophagy response induced by hypoxic stress in plain area is crucial for cell metabolism and homeostasis. Whether acute gastrointestinal reactions or gastrointestinal diseases induced by acute hypoxia in plateau area can also cause a similar effect of autophagy and play a protective role to the intestinal epithelial injury is unknown to date. In our previous study, we found that acute hypoxia in plateau area was not only more likely to cause damage in rat intestinal epithelium, intestinal microflora and inflammatory cytokine imbalance, but also induced a state of autophagy activation comparing with the plain area. Therefore, we are asking whether we could protect the intestinal epithelium from acute hypoxia in high altitude and thus prevent gastrointestinal diseases in plateau area by regulating the activity of autophagy. The current project is proposed to simulate intestinal epithelium and rat models of acute hypoxia in plateau area so as to explicate the correlations among hypoxia, autophagy，hypoxia-related genes and damage of intestinal epithelium, to understand the mechanism of autophagy signal pathway (PI3K/Akt/mTOR) on the intestinal epithelial injury induced by acute hypoxia in plateau area. The success of our study may provide theoretical and experimental evidence for the novel prevention and treatment of gastrointestinal disorders in plateau area.

肠上皮细胞及肠黏膜屏障损伤是导致多器官功能障碍的始动环节。非高原状态下缺氧等应激诱导的自噬反应，对维持细胞代谢及内环境稳定起着重要的保护作用。高原状态下急性缺氧可致急性胃肠反应或胃肠病，是否也可引起平原缺氧类似的自噬效应，对肠上皮损伤也起到保护作用，目前尚缺乏有关研究。我们前期在高原实地及模拟高原缺氧环境实验中发现，与平原相比，高原急性缺氧不仅更易引起大鼠肠上皮细胞损伤、肠微生态及炎性细胞因子失衡，而且还初步证实了自噬活化现象的存在。那么能否通过调控自噬活性来保护高原缺氧性肠上皮细胞损伤、防治高原胃肠病？本课题拟通过模拟高原急性缺氧环境肠上皮细胞与大鼠模型试验，明确高原缺氧、自噬应激、低氧相关基因与肠上皮细胞损伤间的作用关系，探讨其自噬信号通路（PI3K/Akt/mTOR）调控对高原急性缺氧性肠上皮损伤的影响机制，有可能发现一种高原胃肠应激适应的新机制，为高原胃肠病防治提供理论与实验依据。

一、项目背景.高原肠黏膜及黏膜屏障的损伤常见，但机制不祥。自噬参与的缺氧应激反应是维持细胞代谢及内环境稳定的重要机制之一。本项目主要通过建立缺氧细胞模型和动物模型，研究自噬体的形成，低氧相关基因、自噬功能状态等各项指标的变化来探讨高原急性缺氧性肠上皮损伤的调控机制及其效应。.二、主要研究结果.1 体外IEC-6细胞实验 .（1）细胞存活率：缺氧6h、12h细胞存活率出现下降，24 h、48 h明显下降。3-MA处理后，12h开始显著下降，24h、48h下降更明显；.（2）自噬体：缺氧6h后出现双层膜结构的自噬体，随缺氧时间的延长而增加，24h最明显；3-MA干预后，自噬体显著减少；.（3）自噬相关蛋白表达：LC3及Beclin-1表达均显著高于常氧组，24h达到最高，随后下降。3-MA干预后其表达较缺氧组明显减少；缺氧组细胞p-Akt蛋白表达高于对照组，3-MA干预后，p-Akt蛋白表达量显著下降；Akt无明显变化。.（4）低氧相关基因蛋白表达：EGLN1核酸、蛋白的表达水平与氧浓度呈负相关，EPAS1、PPARA核酸、蛋白的表达水与氧浓度无相关性。.2 模拟缺氧动物模型实验.（1）HE染色：肠组织损伤随海拔升高与缺氧时间延长加重，重者出现水肿、缺血坏死，上皮层与固有层分离。.（2）自噬体：缺氧肠组织中存在自噬体样结构，于48h明显增多，自噬抑制组自噬体减少，自噬增强组48、72h均见较多自噬结构。 .（3）缺氧相关蛋白及基因表达：EPAS1、EGLN1、PPARA在高原缺氧肠上皮组织中的表达与海拔高度、缺氧时间呈正相关，对照组低表达或不表达，海拔6000米缺氧72h时表达最强。.（4）自噬相关蛋白、通路蛋白及基因表达：其表达均与海拔高度、缺氧时间有关。海拔3000m，缺氧24h时 LC-3、Beclin-1、Akt表达最低，P70s6k表达最高，随海拔升高，缺氧时间延长，LC-3、Beclin-1、Akt表达增高，P70s6k降低。.三 科学意义 .高原肠黏膜损伤机制复杂，涉及缺氧程度、自噬反应等。研究结果初步揭示特定缺氧环境下早期启动自噬，通过自噬信号通路（PI3K/Akt/mTOR）有助于肠黏膜功能的保护，而抑制自噬则加重其肠粘膜损伤，这种高原肠黏膜损伤特点和保护机制，为高原胃肠病防治提供了基本的理论与实验依据。