利用斑马鱼幼鱼尾鳍切除模型研究白介素(il)1b在吞噬细胞迁徙及尾鳍再生中的作用及机理

Mononuclear (marophage) and polymorphonuclear (granulocyte) phagocytes migration and their roles in the regeneration after tissue disruption are very important questions that are still not well answered. Taking advantage of Tg(coro1a:eGFP;lyz:Dsred) reporter line that can distinguish granulocyte from macrophage at the same time and the powerful regeneration ability of zebrafish, the roles and mechanisms of il1b in granulocyte & macrophage migration and fin regeneration after amputation will be well dissected in this project. The preliminary study indicated that knockdown of il1b in the morphants could lead to the obvious decrease of neutrophils in the wound after fin amputation , but did not show significant influence on macrophages, suggesting distinct mechanisms under the migration of these two subtypes. Future study will mainly focus on subsequent issues: 1) Creating il1b mutant fish by TALEN and confirm the phenotype of il1b knockdown; 2) Analyzing the influence of il1b on the process of phagocytes especially granulocyte migration towards the wound; 3) Studying the role of il1b in the fin regeneration; 4) Establishing Tg(hsp70:GAL4-stop-14xUAS-il1b-14xUAS-CFP)、Tg(lyz:loxP-stop-loxP-il1b-MYC) and Tg(mpeg1:loxP-stop-loxP-il1b-MYC)transgenic lines; 5) Digging out the molecules downstream of il1b by microarray; 6) Exploring the mechanisms of il1b in the phagocyte migration and fin regeneration.

通过区分标记单核(巨噬细胞)和多核(粒细胞)吞噬细胞的Tg(coro1a:eGFP;lyz:Dsred)和其强大的尾鳍再生能力，本课题主要关注il1b在斑马鱼幼鱼尾鳍切除后巨噬细胞和粒细胞的迁徙及随后的尾鳍再生中所发挥的具体作用和相关机理。我们初步在斑马鱼中克隆了il1b并检测了它在尾鳍受损后的表达图谱。在il1b knockdown时，粒细胞在伤口的富集受到明显抑制，但巨噬细胞的影响不明显。今后将重点关注：1) 创建il1b的突变体并确认表型的特异性；2) il1b 对吞噬细胞尤其是粒细胞向伤口迁徙的行为学影响的具体阶段；3)il1b对尾鳍再生的影响；4)构建Tg(hsp70:GAL4-stop-14xUAS-il1b-14xUAS-CFP)、Tg(lyz:loxP-stop-loxP-il1b-MYC) 等品系，结合基因芯片结果阐明il1b的作用机理。

机体受损后粒细胞和巨噬细胞等吞噬细胞有序迁移至伤口，清除病原体和坏死细胞、消除炎症、恢复稳态、促进组织再生。因此，修复再生的顺利进行离不开吞噬细胞的有效迁移和有序协作。il1b是众所周知的炎症因子，il1b通过结合其受体il1br，招募 Myd88，Tollip，TRAK等形成活性复合体，激活下游的NF-κB等信号通路，引起炎症反应。进一步研究发现il1b表达的强弱与炎症反应中粒细胞数目的多少正相关，提示il1b在诱导粒细胞聚集中发挥重要作用。但il1b是否引起粒细胞富集以及作用机理知之甚少。. 本项目以斑马鱼幼鱼尾鳍切除为模型，细致观察了il1b在尾鳍切除后不同时期的表达图谱。通过morpholino介导的功能抑制，深入研究了il1b对于尾鳍受损后巨噬细胞和粒细胞免疫应答的影响。研究表明，il1b对于粒细胞向伤口处的迅速迁移作用重大，而对巨噬细胞的迁移作用有限。myd88是与il1b一同作用于粒细胞免疫应答的重要因子。当Myd88被敲低时，粒细胞的迁徙也会受到抑制，而il1b和myd88同时功能缺陷时，抑制作用会加强，提示il1b-myd88信号通路在粒细胞免疫应答和细胞迁移中的重要作用。但il1b-myd88信号通路与ROS信号通路在调控吞噬细胞应答迁移中的作用相互独立。整个研究成果发表在《Journal of Immunology》。在课题执行中，研究发现ROS探针能特异标记斑马鱼幼鱼肠道，便于活体观测幼鱼肠腔的形成。通过药物处理，本研究建立了“阿片类药物引起的肠功能紊乱疾病（Opioid-Induced Bowel Dysfunction (OIBD)”斑马鱼模型。进一步研究发现这种症状的产生源于乙酰胆碱信号通路活性的抑制。此项成果发表在《Scientific Reports》。为了进一步研究il1b-myd88对于吞噬细胞在细菌感染状态下免疫应答的影响，本研究成功建立了斑马鱼幼鱼的严重细菌感染模型，实时观测了巨噬细胞和粒细胞吞噬和清除细菌的动态过程，进一步解析了严重细菌感染导致的髓系应急造血过程。通过转录组分析找出数个在髓系应急造血发生中改变的作用因子，着重关注Pu.1在正常和应急状态下髓系细胞发育中的作用。结果表明Pu.1促进正常巨噬细胞发育却抑制感染状态下巨噬细胞扩增。成果发表在《Scientific Reports》。