利用单细胞测序技术探索结直肠癌肿瘤干细胞的异质性

Cancer stem cell (CSC) plays an important role in the development of colorectal cancer. Colorectal CSCs can be isolated with cell surface markers including EpCAM(high)CD44(+) and EpCAM(high)Lgr5(+), etc. Recently, we have analyzed the genome of single cells isolated by these two sets of biomarkers via single cell whole genome sequencing, and our preliminary data suggest that 1) each colorectal tumor in general follows a common copy number variation (CNV) pattern; while 2) CSCs expressing the same surface marker from the same tumor could have more than one CNV patterns, indicating its heterogeneity. This project aims to investigate the genomic variation and transcriptome heterogeneity of CSCs purified with EpCAM(high)CD44(+) and EpCAM(high)Lgr5(+). We will first analyze the relationship between different CSC subpopulations during tumor revolution by single cell whole genome sequencing. And then determine the heterogeneous gene expression pattern of CSCs via single cell transcriptome sequencing, and perform hierarchical clustering according to certain genes. Finally, we will explore the correlation of CSC subpopulations with colorectal cancer genotype classification. This study will shed light on understanding CSC heterogeneity and its clinical relavance.

肿瘤干细胞在结直肠癌的形成、转移和复发中扮演重要角色。前期工作中我们通过对结直肠癌EpCAM(high)CD44(+)及EpCAM(high)Lgr5(+)肿瘤干细胞进行单细胞基因组测序发现，不同患者肿瘤干细胞的基因拷贝数变异模式具有个体特异性，同一患者用相同标志物分选的肿瘤干细胞具有不同的基因拷贝数变异模式，即具有异质性。本项目拟在此基础上，探索结直肠癌肿瘤干细胞在基因组和表达层面的特异性及异质性。首先应用单细胞基因组测序技术，探索不同患者基因组拷贝数变异的个体特异性，深入分析同一患者肿瘤干细胞亚群之间的进化关系。然后根据单细胞转录组测序数据得到基因表达谱信息，探究不同肿瘤干细胞之间基因表达的异质性。在此基础上以特定表达的基因为依据，对单细胞进行聚类分析。最后结合临床资料，初步探索不同肿瘤干细胞亚群与肿瘤基因分型的关系。上述研究将为阐明结直肠癌肿瘤干细胞的异质性及其临床相关性奠定基础。

结肠直肠癌是具有复杂分子亚型的异质恶性肿瘤。我们进行了多区域全外显子组测序和单细胞全基因组测序，以检查直肠肿瘤的基因组肿瘤内异质性（ITH）。我们对具有相同分子分类的肿瘤的两个直肠癌患者的9个肿瘤区域和88个单细胞进行了测序，并在多区域和单细胞水平上表征了它们的突变谱和体细胞拷贝数改变（SCNA）。在两个患者之间观察到可变程度的基因组异质性，并且当在单细胞水平上分析时ITH的程度增加。我们发现主要的SCNAs是癌症发展的早期事件并且稳定地继承。单细胞测序揭示了在大量测序中隐藏的突变和SCNA。两名来自相同分子亚型的初治患者的突变情景和SCNA概况完全不同。这些结果表明每个肿瘤都有自己的结构，这可能导致不同的诊断，预后和药物反应。在我们研究的两名患者中存在显着的ITH。.肿瘤干细胞（CSC）被认为是肿瘤发生和复发的原因。 EpCAMhighCD44 +肿瘤细胞是表达高水平干细胞基因的结直肠癌CSC，而EpCAMhighCD44-群体主要含有分化的肿瘤细胞（DTC）。本研究旨在确定单个CSC（EpCAMhighCD44 +）和DTC（EpCAMhighCD44-）是否可以在体细胞拷贝数变异（SCNA）方面进行区分。我们应用荧光激活细胞分选从两个原发性结肠肿瘤中分离出CD45-EpCAMhighCD44 +和CD45-EpCAMhighCD44-群体，然后在其上进行低覆盖率的单细胞全基因组测序（WGS）。我们在单细胞层面比较了CSC和DTC的SCNA。单细胞SCNA图谱显示每个患者的CSC和DTC均存在明显的SCNA，并且每个患者具有特定的拷贝数改变模式。分层聚类和相关性分析均显示来自同一患者的CSC和DTC的SCNA概况具有相似的SCNA模式，而某些患者的CSC和DTC存在区域差异。同一患者中CSC的SCNA具有高度可重复性。我们的数据表明，主要的SCNA发生在早期阶段并且是稳定遗传的。 CSC和DTC之间普遍存在的SCNA的相似性可能源于谱系分化。来自同一患者的CSC具有可重复的SCNA谱，表明某些染色体的获得或丢失是结肠癌发展所必需的。