Smac调控PD-L1参与大分割放疗对非小细胞肺癌免疫微环境影响的作用及机制研究

High PD-L1 expression induced immune evasion was associated with radiation resistance in non-small cell lung cancer (NSCLC). Recent strategies of immunotherapy to enhance tumor antigenicity and T cell–induced responses against solid tumors have shown considerable promise to reverse immune evasion.Our previous studies showed that Smac functioned as pro-apoptosis protein that could enhance the radiosensitivity of NSCLC and activate the host immune response when combining with hypofracionated radiotherapy; while PD-L1 was also inhibited by Smac. Therefore, we made a scientific hypothesis that Smac / PD-L1 pathway may be an important mechanism for radiation resistance-mediated immune evasion. In this project, we aim to explore the mechanism and function of Smac / PD-L1 on radiation resistance-mediated immune evasion by ELISA, Flow Cytometry , Luciferase reporter gene and MicroArray in tumor cell/T cell co-culture model and syngeneic orthotopic lung cancer model. These translational studies provide new strategies for combination treatment of radiotherapy and immunotherapy in NSCLC.

非小细胞肺癌（NSCLC）放射治疗抵抗和放疗后免疫检查点PD-L1上调导致的免疫逃逸相关。提高肿瘤免疫原性、改变肿瘤免疫抑制微环境、增强效应性T细胞功能有望改善肿瘤免疫逃逸，从而逆转放疗抵抗。申请者前期研究发现：Smac是促凋亡因子，与大分割放疗联合能提高NSCLC放射敏感性，激活宿主抗肿瘤免疫反应；Smac和PD-L1负相关并能抑制PD-L1表达。据此推测Smac/PD-L1通路是放疗抵抗引起免疫逃逸的关键通路。本课题拟检测NSCLC标本中Smac和PD-L1表达，以肿瘤细胞/T细胞共培养体系、LLC-OVA小鼠移植瘤模型为研究对象，运用ELISA、流式细胞术等观察Smac/PD-L1调节抗肿瘤免疫反应，并通过基因芯片、荧光素酶报告基因等手段，检测Smac调节PD-L1机制以验证该假说，为NSCLC放疗联合免疫治疗的临床转化研究提供新策略。

立体定向消融放射治疗在治疗早期、局部晚期肿瘤或寡转移肿瘤已与手术效果媲美。除了局部控制，立体定向消融放疗改变了肿瘤局部免疫微环境，产生抗肿瘤免疫抗原，增加杀伤性T细胞的浸润和细胞因子释放来达到全身病灶的消退。尽管如此，放疗抗拒导致的肿瘤局部复发和远处转移，仍然是治疗失败的主要模式。因此，本课题旨在探索立体定向消融放疗联合免疫治疗的机制，为临床治疗方案提供新策略。.研究内容：通过建立LLC-OVA小鼠移植瘤模型，评价大分割立体定向消融放疗联合Smac Mimetic Debio 1143的抗肿瘤免疫作用。流式细胞术分析肿瘤免疫微环境中的肿瘤特异性CD8+ T淋巴细胞以及功能的活化、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和调节性T细胞(Tregs)。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-γ（IFN-γ），白细胞介素-10 (IL-10)和白细胞介素-1β (IL-1β)水平，探讨肿瘤抗原对T细胞启动的重要作用。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-γ（IFN-γ）以及免疫抑制性细胞因子Arg-1和IL-10的表达。.研究结果：Debio 1143显著提高了立体定向消融放疗的治疗疗效，延长了生存时间。肿瘤特异性OVA+CD8+ T细胞在Debio1143联合立体定向消融放疗组中升高，OVA+CD8+ T细胞表达的IFN-γ和TNF-α水平升高，表明联合组能诱导强烈的肿瘤抗原特异性适应性免疫反应。Debio1143增强了立体定向消融放疗在抗原提呈和T淋巴细胞启动水平上诱导肿瘤特异性Tc1细胞效应的能力；显著减少肿瘤免疫微环境（TME）中MDSCs的数量。联合应用立体定向消融放疗和Debio1143有助于消除肿瘤免疫微环境内的免疫抑制细胞。Debio1143联合大分割立体定向消融放疗促进炎性细胞因子释放，其抗肿瘤免疫效应依赖于CD8+ T淋巴细胞，并由TNF-α和IFN-γ介导。.结论：Smac Mimetic联合立体定向消融放疗对肺癌有持久的抗肿瘤免疫作用，这种作用由TNF-α和IFN-γ介导，依赖于CD8+ T细胞，从而抑制肿瘤免疫微环境中的MDSC细胞，为肺癌免疫治疗联合立体定向消融放疗提供新策略。