miR-145-5p靶向PRKCI调控PI3K/AKT介导自噬对喉鳞癌细胞化疗敏感性的影响及机制研究

Invasion and neck lymphatic metastasis are major malignant features of Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC), and insensitivity to chemotnerapy limits the improvement of prognosis of LSCC. Autophagy-dependent apoptosis is able to augment chemotherapy-trigerred cytotoxicity that enhances LSCC sensitivity, however, autophagy is downregulated in LSCC. microRNA plays critical roles in regulation of autophagy. Our previous work showed that the tumor-suppressive miR-145-5p induces autophagy of LSCC cells, and miR-145-5p inhibits PRKCI expression. The PI3K/AKT signaling pathway is highly activated in LSCC. Activation of PI3K/AKT signaling promotes proliferation, invasion and migration, but inhibits autophagy. It has been reported that PRKCI activates PI3K/AKT signaling pathway through phosphorylation of PI3K and AKT. Hence, we speculated that downregulation of miR-145-5p in LSCC upregulates PRKCI, thus activating PI3K/AKT signaling and inhibiting autophagy, promoting proliferation, invasion and migration, thereby altering the sensitivity of LSCC to chemotherapy. In this study, CRISPR/Cas9, gain/loss of function and dual-luciferase reporter assay will be introduced to unravel the potential effects and mechanism of miR-145-5p/PRKCI-regulated PI3K/AKT on autophagy and chemotherapeutical sensitivity in laryngeal squamous cell carcinoma, both in vitro and in vivo. This study will provide new target for molecular targeted therapy of LSCC.

喉鳞癌具有侵袭及颈淋巴结转移的恶性特征，化疗不敏感是阻碍其综合治疗提升预后水平的主要瓶颈。自噬依赖的凋亡能够增强化疗产生的细胞毒性，从而增强细胞对化疗的敏感性，但喉鳞癌中自噬受阻。microRNA对自噬具有重要调控作用。我们前期研究发现miR-145-5p诱导喉鳞癌细胞自噬并靶向调节PRKCI，目前尚未见报道。PRKCI是自噬抑制通路PI3K/AKT重要的激酶，PI3K/AKT在喉鳞癌中异常激活，促进细胞增殖及侵袭转移。由此推测miR-145-5p下调致PRKCI堆积，进而激活PI3K/AKT抑制自噬活性，促进喉鳞癌细胞增殖及侵袭转移，影响喉鳞癌化疗敏感性。本项目拟利用CRISPR/Cas9、gain/loss of function及报告基因分析并结合体内外实验，揭示miR-145-5p/PRKCI调节PI3K/AKT对喉鳞癌细胞自噬和化疗敏感性的影响及可能的机制，以期为喉鳞癌分子靶向治疗提供新靶标。

喉鳞癌仅次于肺癌的第二大呼吸道高发肿瘤，在包括山西省在内的中国北方高发。喉具有呼吸、发音、吞咽和社交等重要功能。罹患喉鳞癌后，患者生存及生活质量均受到严重损害。目前，喉鳞癌以手术为主的综合治疗虽能提高局部控制率及喉保留率, 但患者的远期生存率却无明显改善。易局部侵袭、颈淋巴结转移及化疗抵抗的恶性行为是喉鳞癌治疗后复发的重要原因，严重干扰患者远期疗效及生存率。本项目通过体内外实验研究了miR-145-5p和PRKCI对喉鳞癌增殖、迁移、侵袭、体内成瘤及化疗敏感性的调控作用。并研究了miR-145-5p和PRKCI之间的调控关系及二者对下游AKT信号通路和自噬的调节机制。此外，本项目还研究了miR-145-5p和PRKCI表达水平与喉鳞癌患者临床病理参数的相关性。研究结果表明：miR-145-5p通过激活自噬抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭，增强喉鳞癌细胞化疗敏感性；而PRKCI抑制细胞自噬，促进喉鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭和化疗抵抗能力。机制研究表明miR-145-5p直接结合PRKCI 3' UTR抑制其表达，从而降低PRKCI介导的AKT磷酸化水平，增强喉鳞癌细胞自噬活性。调节AKT通路活性能够逆转miR-145-5p和PRKCI对喉鳞癌细胞恶性表型的调控效应。同样，通过小分子抑制剂调节细胞自噬活性能够抵消miR-145-5p和PRKCI对喉鳞癌表型的影响。最后，我们对临床喉鳞癌样品miR-145-5p和PRKCI表达的研究发现，miR-145-5p表达水平与喉鳞癌恶性进展负相关，而PRKCI高表达与喉鳞癌恶性进展正相关。综上，本项目研究结果为了解喉鳞癌侵袭转移和化疗抵抗的分子机制提供了新的观点，也为喉鳞癌诊断和靶向治疗提供了新的标志物和靶点，对提升喉鳞癌预后水平具有重要意义。