BmSlit及其受体BmRobo对家蚕丝腺发育的调控机理研究

The silk gland of silkworm is an organ synthesizing and secreting silk, which is the biological basis of the entire silk industry. But much is still unknown about the molecular mechanism underlying the formation and development of silk gland. Slit and its receptor Robo participate in many developmental processes in diverse cell types, such as neuronal cells, vascular endothelial cells and muscle cells. There has been no relevant report about the functional study of Slit and its receptor Robo in the silk gland of the silkworm. In the previous work, we cloned Bmslit and Bmrobo in the silkworm. We found that they played a role in the development of nervous system and were localized in the silk gland. Meanwhile, their regulatory factor BmTbx20 was also expressed in the silk gland. The present study is proposed to investigate the gene expression pattern of Bmslit, Bmrobo and Bmtbx20 in the silk gland by in situ hybridization and antibody staining, the interaction between BmSlit and BmRobo by co-immunoprecipitation, functional verification of Bmslit, Bmrobo and Bmtbx20 in the silk gland by RNAi technology, and regulation of Bmslit and Bmrobo genes by BmTbx20 using qPCR and ChIP. The results will offer a new theoretical basis for gene regulatory networks of the development of the silk gland in the silkworm.

丝腺是家蚕的泌丝器官，是整个蚕丝业的生物学基础，但丝腺形成与发育的分子机制目前尚有很多不明之处。Slit及其受体Robo参与神经、血管内皮细胞、肌肉等多种类型细胞的发育过程，但是在家蚕丝腺中的功能研究还没有相关报道。在前期工作中，我们克隆了家蚕Bmslit和Bmrobo基因，发现它们不仅在家蚕神经发育中发挥作用，也在丝腺中定位，同时发现其调控因子BmTbx20也在丝腺表达。本课题拟通过原位杂交和抗体染色方法确定Bmslit、Bmrobo和Bmtbx20基因在丝腺的表达模式，采用免疫共沉淀方法检测BmSlit和BmRobo之间的相互作用，通过RNAi技术验证Bmslit、Bmrobo和Bmtbx20基因在丝腺中的功能，利用定量PCR和染色质免疫共沉淀技术分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用，相关研究结果可为家蚕丝腺发育的基因调控网络提供新的理论依据。

家蚕是一种具有重要经济价值的吐丝昆虫，丝腺是合成和分泌蚕丝的重要器官。尽管目前对于家蚕丝腺发育的分子调控研究已取得许多重要进展，但仍有许多不明之处。已有研究表明，神经轴突导向因子Slit及其受体Robo在神经系统发育、血管生成、心脏形态发生、肿瘤转移等多种生命活动中发挥着重要作用，但是Slit-Robo信号通路在家蚕丝腺中的功能还没有相关报道。在前期工作中，我们在家蚕中克隆了1个slit基因（Bmslit）、3个robo基因家族成员（Bmrobo1a、Bmrobo1b和Bmrobo2/3）以及转录因子tbx20基因（Bmtbx20）。在此基础上，本项目对家蚕Bmslit、Bmrobo、Bmtbx20基因在丝腺的时空表达模式、功能以及BmTbx20对Bmslit、Bmrobo基因的表达调控进行了研究。通过定量PCR技术发现Bmslit、Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3和Bmtbx20基因在不同龄期家蚕幼虫的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺都表达。通过抗体染色方法从蛋白水平上分析BmSlit、BmRobo和BmTbx20在家蚕胚胎和幼虫丝腺的亚细胞定位，发现BmSlit定位在细胞质和细胞间隙，BmRobo1a、BmRobo1b定位在细胞质，BmRobo2/3、BmTbx20定位在细胞质和细胞核。对Bmslit、Bmrobo和Bmtbx20基因进行RNA干扰，定量PCR结果显示RNA干扰后目的基因的表达量下降。对Bmtbx20进行RNA干扰后，Bmslit和Bmrobo基因的表达下降，与对照家蚕相比，家蚕个体发育受到影响，丝腺变小。相关研究结果有助于揭示家蚕丝腺形成和发育的内在分子基础，同时也为培育具有优良茧丝性状的家蚕品种提供了理论参考。