天然化合物Guttiferone K调节线粒体核糖体蛋白选择性杀死静止期前列腺癌细胞的机理研究

The survival and re-proliferation of Quiescent Cancer Cell (QCC) has been concerned as a main cause of cancer recurrence. Unfortunately, there is no effective drug specifically target on QCC. In our previously study, we have identified that Guttiferone K(GUTK), isolated from Garcinia yunnanensis Hu, could inhibit prostate cancer by blocking reactivation of QCC. We also found GUTK could specifically induce chemo-resistant QCC death in vitro and prevent cancer recurrence after chemotherapy in vivo. Proteomics results show that GUTK may target on mitochondrial ribosomal pathway. As many as ten mitochondrial ribosomal protein (MRPs) were down regulated after GUTK treatment. Based on the research work above, this project will further investigate the mechanism of GUTK on MRPs by using multiple techniques, including BIAcore SPR, BN-PAGE, Western blot, 35S-labelled amino acid and Dox-inducible gene expression system. The underlying molecular mechanisms of the inhibitory effect of GUTK on cancer recurrence will be explored in animal model. The achievements of the project could provide the scientific basis for indicating that GUTK acts as a promising agent on preventing cancer recurrence, and suggest MRPs as new target for the drug screening on cancer recurrence prevention, which could in turn enlighten a new mode of cancer therapy.

静止期癌细胞(QCC)的残留和重新增殖是导致癌症复发的重要原因，目前尚无针对QCC的药物。前期工作中，我们报道了云南藤黄中的Guttiferone K(GUTK)具有抑制QCC激活从而抑制前列腺癌的作用；后续研究发现GUTK不仅可在体外选择性杀死化疗药物耐受的QCC，动物实验中也能抑制化疗后的肿瘤复发。蛋白组学发现GUTK主要作用于线粒体核糖体通路，下调了10个线粒体核糖体家族蛋白(MRPs)。为阐明GUTK如何调控MRPs及MRPs在QCC存活中的作用，本研究将采用BIAcore SPR技术，研究GUTK与MRPs蛋白的亲和能力；结合BN-PAGE，免疫印迹，35S氨基酸标记，构建Dox-诱导的基因表达系统等技术，探讨体内外GUTK诱导QCC死亡的作用机理。本项目的成果将为GUTK开发成抑制癌症复发的药物提供理论依据。MRPs作用的阐明将为预防癌症复发药物的筛选提供新靶标和新思维。

肿瘤组织中既包括快速生长分裂的增殖期癌细胞，也有暂停细胞周期的静止期癌细胞(Quiescent Cancer Cells，QCCs)。放化疗后，增殖期癌细胞死亡，放化疗耐受的QCCs重新进入细胞周期，开始快速增殖，导致肿瘤复发。目前尚无针对QCCs的药物，如果能找到选择性杀死QCCs的低毒副作用药物，可减少肿瘤复发的风险。前期工作中，我们报道了云南藤黄中Guttiferone K(GUTK)具有抑制QCCs激活从而抑制前列腺癌的作用，并且在体外可杀死化疗药物耐受的QCCs。本项目着重于探究GUTK选择性诱导QCC死亡的体内外活性，及其发挥作用的分子机制和关键通路。.本研究首先验证了化疗药抑制增殖期前列腺癌细胞生长的同时，对静止期前列腺癌细胞无明显细胞毒作用。SYBR Green和PI Exclusion实验证明GUTK能选择性诱导静止期前列腺癌细胞死亡，而对增殖期前列腺癌细胞、人正常前列腺基质细胞和人正常肝细胞几乎无效。原位移植瘤模型实验证明，在 Docetaxel治疗间期给予GUTK可增强疗效。iTRAQ蛋白组学发现GUTK下调了静止期LNCaP细胞中10个线粒体核糖体家族蛋白(MRPs)。且QCCs中MRPs蛋白表达远高于增殖期癌细胞。前期报道，MRPS34蛋白对肿瘤细胞存活具有一定调控作用。敲除MRPS34的静止期PC-3细胞裸鼠皮下移植瘤生长减缓，证明MRPS34在QCCs存活中有重要作用。因此我们深入探究GUTK对MRPS34蛋白的调控作用，敲除MRPS34 能增强GUTK诱导的静止期前列腺癌细胞死亡；而过表达 MRPS34 可明显逆转GUTK诱导细胞死亡的作用。BIAcore显示GUTK与MRPS34蛋白有一定结合，RT-PCR结果表明GUTK对MRPs的转录水平无影响，进一步研究证明GUTK下调MRPS34蛋白水平的作用部分是通过促进MRPS34的泛素-蛋白酶体降解途径。BN-PAGE结果显示，GUTK抑制MRPs下游的氧化磷酸化复合物，影响线粒体膜电位，激活线粒体依赖的凋亡通路。裸鼠皮下移植瘤模型实验显示Docetaxel治疗后，给予GUTK可抑制肿瘤生长，减少复发风险。IHC结果表明GUTK在体内也能下调Ki-67和MRPS34蛋白并诱导凋亡。本项目为GUTK开发成抑制癌症复发的药物提供了理论依据，发现了预防癌症复发药物的筛选新靶标MRPS34。