丹参素激活HDAC 3介导的软骨内成骨防治骨折延迟愈合的机制研究

The underlying mechanism of disorders of bone union remains unclear so far, but it is closely linked to the impaired endochondral ossification. We previous found that glucocorticoid (GC) would impair endochondral ossification and further induced delayed fracture union. Salvianic acid A could accelerate the healing of delayed fracture union induced by GC. However, the mechanism remains unclear. Recent studies have indicated that histone deacetylase 3 (HDAC 3) could regulate cartilage development and endochondral ossification. We previously found that GC induced delayed fracture union was closely related to the suppression of HDAC 3. Therefore, we speculate that salvianic acid A could stimulate the HDAC 3-mediated endochondral ossification to prevent delayed fracture union induced by GC. To date, no research have reported the role of HDAC 3 in delayed fracture union and it may be a new therapeutic target for the treatment of disorders of bone union. In the present study, we will use HDAC 3 inhibitor and GC to induce impaired-chondrocyte cell models. HDAC 3 expression and relevant signaling pathway of endochondral ossification will be investigated on the cell models and the cell models with HDAC 3 overexpression and salvianic acid A treatment intervention. Finally, GC-induced delayed fracture mouse model will be used to further validate the underlying molecular mechanism. We here attempt to determine whether salvianic acid A is capable of upregulating HDAC 3-mediated endochondral ossification for the prevention and treatment of GC-induced delayed fracture union. The results of this study will provide new idea and new target for the prevention and treatment of the disorders of bone union.

骨折愈合障碍迄今机制未明确，但其与软骨内成骨关系甚密。我们前期研究发现，糖皮质激素（GC）可诱导软骨内成骨障碍进而导致骨折延迟愈合，丹参素骨靶向制剂可防治GC诱导的延迟愈合，然而其机制未明。新近报道组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）可调控软骨发育和软骨内成骨。我们发现GC诱导骨折延迟愈合与其抑制HDAC3表达相关。因此，我们推测丹参素可激活HDAC3介导的软骨内成骨发挥作用。迄今国内外尚无报道HDAC3在骨折修复障碍中的角色，其可能是骨折愈合障碍治疗的新靶点。本项目拟采用HDAC3抑制剂及GC干预的方法制备软骨细胞发育障碍模型，使用HDAC3过表达及丹参素进行干预，检测干预前后HDAC3及软骨内成骨相关通路的变化，最后再以GC诱导的骨折延迟愈合动物模型进行机制验证，探讨HDAC3在骨折愈合障碍中的作用及丹参素对抗骨折延迟愈合的具体机制。此研究将为骨折愈合障碍相关疾病的防治提供新思路和新靶点。

骨折愈合障碍迄今机制未明确，但其与软骨内成骨关系甚密。本项目系统性通过一系列动物实验以及细胞实验对丹参素(SAA)是否通过组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)介导的软骨内成骨促进骨折愈合障碍的治疗进行了探索。1. 以地塞米松(DEX)对小鼠骨髓间充质干细胞(C3H10)以及人软骨细胞(C28)造成软骨细胞发育及功能障碍模型，观察GC对软骨细胞发育、功能及HDAC3表达的影响。数据显示GC明显抑制软骨细胞的功能和骨髓间充质干细胞成骨功能与GC明显抑制HDAC3的表达有关。2. 研究显示SAA通过调控HDAC3对抗GC造成的软骨细胞发育及功能障碍。以DEX对C3H10，C28造成软骨细胞发育及功能障碍模型，以及使用敲低HDAC3的前软骨细胞(ATDC5)细胞模型，观察SAA对细胞模型的发育、功能及HDAC3表达的影响。数据显示GC显著抑制骨髓间充质干细胞及软骨细胞的HDAC 3的表达，并显著抑制软骨细胞的发育和功能，同时也抑制骨髓间充质干细胞成骨功能，敲低HDAC3细胞模型与GC诱导的细胞模型在许多指标上相似。而SAA的使用能够很好的对抗GC产生的作用并通过调控HDAC3 提高细胞模型中的成软骨，软骨内成骨及成骨的关键指标基因的表达。3. 研究SAA及其骨靶向制剂(SAA-BTL)用于骨折愈合障碍模型的治疗作用，并明确了SAA通过HDAC3调控软骨内成骨治疗骨折延迟愈合的调控机制。本研究建立了激素诱导的骨折延迟愈合小鼠模型，并对其进行了完整的表征。在前期研究的基础上，进一步优化完成了SAA-BTL的制备、分析及在体内、体外的骨靶向性验证。研究数据表明SAA及SAA-BTL在GC诱导的小鼠骨折愈合障碍模型，家兔骨不连模型以及GC诱导的家兔骨坏死模型上均可显著改善骨折骨痂的的形成和骨微结构，加速骨痂矿化率，改善骨折愈合的生物力学性能。SAA及SAA-BTL显著增加体内P-HDAC3、II型胶原、RUNX2、VEGFA和骨钙素的表达，加速软骨的软骨内成骨转化，促进骨折长骨愈合。本研究结果将为骨折愈合障碍相关疾病的防治提供新思路和新靶点。