木质纤维原料中天然漆酶介体的汽爆调控及多介体催化机制

Laccase is one of the most important oxidoreductase with industrialization potential. However, due to the high cost and catalytic toxicity of laccase synthetic mediator, the laccase-mediator-system still can not achieve industrialization. Therefore, searching out high efficient, environment-friendly, and cheap natural mediator from small molecule precursors or intermediates and degradation products of lignin has been considered as the research hot. Therefore, this project, taking the relationship between raw materials, pretreatment, enzymatic mechanism as core, intends to reveal the generation rule of laccase natural mediators from lignocelluloses by dynamic regulated with steam explosion pretreatment, and then to establish a laccase/ steam explosion hydrolyzate multi-mediators system. Firstly, the inhibitors and mediators of laccase in steam explosion hydrolyzate of lignocellulose would be systematically separated and cognized. Secondly, it will clarify the dynamic relationship between the pretreating parameters of steam explosion and the formation of laccase mediators and inhibitors. Thirdly, the catalytic behavior of steam explosion hydrolyzate, a mixture with multiple laccase mediators, will be investigated and a laccase/hydrolyzate natural catalytic reaction system would be directly established to realize the auto-catalysis of hydrolyzate. This project aims to provide the theoretical and technical direction for exploring of high reactive of laccase natural mediators and achieving the oriented high-value utilization of lignocellulose hydrolyzate.

漆酶是未来工业生物催化技术中最重要及最具产业化前景的氧化还原酶之一。但是由于漆酶催化的合成介体存在价格昂贵、催化毒性等问题，其体系一直未能实现工业化。从木质素小分子前体物质或者中间体及降解产物中寻找稳定、高效、低毒和价廉的天然介体成为当前的研究热点和重点。本项目从原料、预处理、酶催化机制三者的关系入手，揭示木质纤维素原料中漆酶天然催化介体的汽爆预处理动态调控规律，构建漆酶/汽爆水解液多介体连续催化体系。本项目将首先借助先进的分析手段对原料汽爆预处理水解液中的漆酶催化底物谱和介体谱进行系统分离和解析；在此基础上，阐明预处理参数与水解液中漆酶催化天然介体及限制因子组成之间的动态关系；最终考察预处理水解液这类多介体混合体系中介体的催化性能，构建漆酶/介体催化体系，实现水解液高效自催化。本项目旨在为挖掘高反应活性的漆酶天然催化介体，实现木质纤维素原料预处理水解液定向高值利用提供理论指导。

漆酶被认为是未来工业生物催化中“可持续环境友好过程生物技术的工具”。然而，目前漆酶介体催化体系一直难以工业化应用，主要原因在于漆酶催化介体多为人工合成介体，存在市场价格昂贵，难确保其本身或其衍生物不具有毒性等问题。寻找稳定、高效、低毒和价廉的天然介体成为当前的研究热点和重点。本项目基于预处理水解液是含有复杂木质素降解产物的天然漆酶多介体混合体系，通过对原料汽爆预处理水解液中的漆酶催化底物谱和介体谱进行系统分离和解析，阐明预处理参数与水解液中漆酶催化介体及限制因子组成之间的动态关系，最终建立基于汽爆预处理水解液的天然漆酶多介体催化体系。.本课题取得的主要研究成果如下：.①根据水解液中物质组成类型建立了基于物质分子量及极性差异的纳滤-有机溶剂连续分级萃取分离的方法，采用GC-MS、LC-MS等先进的分析手段对所得到的分级萃取物进行了鉴定分析。这些萃取物均可作为漆酶天然介体催化染料脱色，且脱色效果优于常用漆酶合成介体ABTS、HBT等。基于GC-MS分析结果认为其中所包含的酚类物质是这些物质可以作为漆酶介体的主要原因，其中最主要的酚类物质是对羟基苯甲醛, 4-乙基愈创木酚和香草醛。.②建立了汽爆强度与水洗液中酚类物质含量的动态关系，并解析了汽爆参数对木质素降解的调控规律。汽爆秸秆水洗液中酚类物质与汽爆强度符合DoseResp模型。机理研究表明在汽爆作用下，木质素会发生解聚和缩合两种反应，提高汽爆强度有利于木质素的解聚，而增加维压时间则导致木质素的缩合。其中解聚主要是醚键的断裂，而缩合作用主要是Cα与G单元的缩合反应。因此可以通过增加汽爆压力，缩短维压时间来尽可能使木质素发生解聚反应，从而提高水洗液中木质素小分子降解产物的种类和浓度。.③对秸秆汽爆水解液中物质组成与浓度进行了全面的解析，在较低浓度的水洗液中漆酶活性呈现的“先被抑制而后逐步恢复活性”的趋势。而按照成分及浓度分析结果进行复配的模拟水洗液显著抑制漆酶的活性，且没有出现漆酶活性逐步回升并高于对照组的过程。基于此，构建了直接以汽爆秸秆水洗液为漆酶天然介体混合物(cocktail)的直接催化染料脱色体系，漆酶/水洗液介体体系催化孔雀绿的80 min脱色率达到92.3%，分别是以ABTS为介体和不添加外加介体的脱色率的2.19倍和2.64倍。不仅降低了漆酶介体催化体系的使用成本，而且实现了汽爆秸秆水洗液的绿色资源