拟南芥多磷酸肌醇激酶基因AtIpk2β激酶活性调控机理研究

三磷酸肌醇激酶基因（IP3K）通过调节IP3和Ca2+在植物的生长发育和环境应答中发挥着重要作用。我们已报道过拟南芥三磷酸肌醇激酶基因（又称多磷酸肌醇激酶基因AtIP3K/AtIpk2β）的鉴定及一系列功能研究。但关于该基因所编码蛋白的激酶活性调控的研究还是空白。我们最近的研究发现：拟南芥多磷酸肌醇激酶AtIpk2β存在二聚化及磷酸化现象。本项目拟通过分子生物学、细胞生物学、生物化学及遗传学等实验手段分析AtIpk2β的二聚化及磷酸化现象及与其激酶活性的调控关系，同时筛选出AtIpk2β的活性调控因子，进一步研究二聚化、磷酸化和调控因子在调控过程中的相互作用关系。这将是国际上首次对植物三磷酸肌醇激酶活性调控机理的报道。

三磷酸肌醇激酶基因（IP3K）通过调节IP3和Ca2+在植物的生长发育和环境应答中发挥着重要作用。我们已报道过拟南芥三磷酸肌醇激酶基因（又称多磷酸肌醇激酶基因AtIP3K/AtIpk2β）的鉴定及一系列功能研究。但关于该基因所编码蛋白的激酶活性调控的研究还是空白。本项目在已有发现的基础上通过分子生物学、细胞生物学、生物化学及遗传学等实验手段分析了AtIpk2β的二聚化、磷酸化现象及与其激酶活性的调控关系。我们筛选到两个调控因子，即SnRK1 (Snf1-Related Protein Kinase-1) 和CDPK4 (Ca2+ -dependent protein kinase)调控AtIpk2β的活性，进一步研究了磷酸化和调控因子在调控过程中的关系。我们通过体外磷酸化实验证实SnRK1能够磷酸化AtIpk2β，并且发现atipk2β突变体对6%葡萄糖抑制的种子萌发比野生型更加敏感，这表明AtIpk2β参与到SnRK1介导的葡萄糖信号通路。进一步通过质谱分析的方法鉴定到CDPK4对AtIpk2β的五个磷酸化位点，第46，128，147位氨基酸突变成丙氨酸之后会影响到AtIpk2β补偿酵母ipk2在37℃下生长缺陷的功能。AtIpk2β过表达转基因拟南芥在ABA抑制的种子萌发与幼苗主根生长实验中比野生型更敏感。这表明AtIpk2β是ABA信号通路中的一个正调控因子，并且CDPK4可能就是通过磷酸化的方式对其活性进行调控。另外，我们发现AtIpk2β以激酶活性依赖的方式参与植物生殖和葡萄糖抑制的种子萌发过程，并且在AtIpk2β参与的葡萄糖信号通路中证实了SnRK1抑制了AtIpk2β的激酶活性。AtIpk2的两个异构体AtIPK2a 和AtIpk2β 以功能冗余的方式参与植物的生殖过程。AtIpk2β激酶活性失活的转基因拟南芥，都不能获得双突变的种子，表明AtIpk2β参与生殖发育跟其激酶活性有关。我们发现IP6能拮抗葡萄糖、ABA和PAC对种子萌发的抑制作用，而AtIpk2β的激酶活性对拟南芥种子中六磷酸肌醇（IP6）的合成非常重要，这表明AtIpk2β以IP6依赖的方式参与葡萄糖对种子萌发抑制的信号通路。进一步通过酵母补偿实验，我们发现SnRK1能够抑制AtIpk2β的激酶活性。总之，本研究主要揭示了磷酸化和调控因子在AtIpk2β调控过程中的关系。