基于化学仿生体系的细菌细胞跨膜信号转导机制研究

For solving the problem of resistance of the Staphylococcus aureus and other pathogenic microorganisms as well as design and development of new antimicrobial agents, it is very important that understanding the bacterial signal transduction mechanism from the perspective of the chemical and clarifying the problem of signal recognition and transmission mechanism of the transmembrane receptor protein on a molecular level. This project is to explore chemical events and mechanism in the process of signal transduction, which is based on transmembrane signal transduction of histidine kinase AgrC in pathogenic bacteria. .The research contents of this project as follows：(1) Synthesis and preparation of major chemical composition including artificial membrane, cyclic peptide signal molecule, receptor protein. (2)According to the bacterial cell transmembrane signal transduction in biological systems, a supramolecular system that can represent bacterium signal transduction will be established at the molecular level in vitro. (3) Examine seinsart of receptor protein AgrC on the membrane, and discuss the effets of the seinsart on signal recognition and transduction by fluorescence resonance energy transfer technology and atomic force microscopy imaging technology..The researches on chemical biomimetic and functional simulation of the signal recognition and transfer of bacterial cell would provide new methods and means for the prevention and treatment of drug-resistant pathogenic bacteria and the development of new antimicrobial agents.

从化学的立场和角度研讨细菌信号转导机制，从分子水平上阐明跨膜受体蛋白的信号识别与传递机制问题，对金黄色葡萄球菌等致病微生物的耐药性问题以及设计开发新型抗菌药物具有非常重要的意义。本项目使用有机化学、化学生物学、超分子化学的方法和手段，以金黄色葡萄球菌的跨膜细胞信号转导为研究对象，明确细菌细胞信号转导过程中的化学事件和机理。研究内容包括：（1）合成和制备人工超分子信号转导体系的主要化学成分，如人工细胞膜、环肽信号分子、受体蛋白等；（2）于生物体系外，建立以人工细胞膜为基体的,能够表达细菌细胞信号转导机能的超分子体系；（3）有效运用荧光共振能量转移技术和原子力显微成像技术检测组氨酸蛋白激酶受体AgrC在膜上的存在形式及其对信号识别及传递机制的作用和影响。通过对细菌细胞的信号识别与信息传递过程的化学仿生和功能模拟研究，将为解决致病细菌的耐药性难题发挥大作用，为开发新型抗菌药物提供新方法和新手段。

细菌细胞利用小分子化合物作为信号分子进行胞外、胞内的信号转导。它们通过群体感应机制检测这些小分子的浓度来感知胞外环境的变化，将胞外信息传递至胞内，从而调控细胞的各种生理行为。本项目以金黄色葡萄球菌agr系统的跨膜信号转导过程为研究对象，以人工细胞膜为载体，组装并构建成功了简单、清楚并易于测试的受体蛋白跨膜的人工细胞膜体系,并利用该体系在生物体系外从分子水平上探索了金黄色葡萄球菌agr信号通路中信号传递的基本途径和调控机理，为新型药物的分子设计、研制开发等提供理论依据。项目主要研究内容和获得的重要结果如下。（1）基于生物膜磷脂结构特点，以氨基酸为连接骨架进行类脂的设计与合成，分别设计合成了持有疏水尾部差异、连接氨基酸差异、极性头部差异的类脂18种，为人工信号转导体系的构建提供了基本素材。（2）以天然磷脂与合成类脂为材料形成的二分子膜作为人工细胞膜，以环八肽AIP为信号分子，以AgrC和荧光蛋白的融合蛋白作为人工受体，由受体形成二聚体引发的激酶活性或荧光共振能量转移为信号转导的胞内效应，构建了人工信号转导体系。在人工细胞信号体系中，60-70%的受体AgrC蛋白保持其二级结构，而在表面活性剂中只有10-20%的AgrC蛋白保持其二级结构，表明人工细胞膜为AgrC蛋白提供了更近天然的膜环境，提高了AgrC蛋白的稳定性。在人工细胞信号体系中，当AgrC蛋白与2倍摩尔浓度的AIP作用时，其激酶活性大幅度提高。（3）组氨酸激酶AgrC是信号转导系统中非常关键的蛋白，其拓扑结构对于AgrC和其信号分子相互识别机制的研究非常关键。本项目利用GFP融合技术和SCAM方法首次确定了AgrC蛋白的膜拓扑结构，证明AgrC含有七个跨膜螺旋，其N端朝向细胞外。（4）利用荧光共振能量转移技术和化学交联法研究了受体二聚体的形成机制，结果表明二聚体结构对于AgrC蛋白的功能活性非常重要，蛋白分子间的聚集并非通过跨膜区和胞内域的半胱氨酸作用。