肠道病毒71型DNA疫苗制备及其免疫效果的优化

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)引起儿童手足口病和多种与神经系统相关的疾病，感染后死亡速度快，病死率高，尤其近年来EV71病毒的流行在亚太地区尤其我国呈上升趋势，但是目前缺乏高效的疫苗预防EV71感染。我们已分离鉴定了本地流行EV71，并构建了含有EV71主要衣壳蛋白VP1、VP2、VP3基因的重组质粒。本课题将在已有研究工作的基础上利用基因工程的方法构建EV71 VP1、VP2、VP3基因 DNA疫苗，用不同基因的DNA疫苗免疫小鼠，比较各基因所引起的免疫应答情况的差异，选择免疫效果最佳的基因EV71 DNA疫苗的候选基因；并从免疫佐剂、粘膜免疫、免疫途径三个方面，对EV71 DNA疫苗的免疫效果进行优化，尤其以减毒沙门氏菌为载体进行粘膜免疫，能模拟肠道病原体的感染途径。本研究将为EV71疫苗的研制和免疫学机制的探讨提供理论依据。

肠道病毒71型是小RNA病毒科肠道病毒属成员，EV71主要感染儿童，引起手足口病，以手、足、口腔等部位发生丘疱疹为主要特征，此外感染严重者还能引起无菌性脑炎、急性迟缓性瘫痪和肺水肿等多种与神经系统相关疾病。自1974年首次报道以来，EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。目前还没有有效的抗病毒药物和疫苗可以使用。因此，急需开发一种有效的疫苗预防EV71感染。本课题利用基因工程的方法将EV71的衣壳蛋白VP1、VP2分别克隆到真核表达载体中，构建EV71 DNA疫苗pcDNA- VP1和pcDNA-VP2。以小鼠为动物模型，通过肌肉注射重组质粒进行免疫接种，分别用间接ELISA检测抗EV71抗体，MTT法测定小鼠体内的淋巴细胞转化功能，细胞因子释放试验检测其分泌的IFN-γ和IL-4水平，FCM检测T淋巴细胞亚型，探讨核酸疫苗的免疫效果。为优化EV71 VP1 DNA疫苗的免疫效果，构建鼠IL12、GM-CSF重组真核表达质粒pcDNA- IL12和pcDNA-GM-CSF，之后通过肌肉接种和pcDNA- VP1共同免疫小鼠，检测IL-12和GM-CSF作为基因佐剂对EV71 VP1 DNA疫苗的免疫调节作用；构建EV71 VP1原核表达载体，转化大肠杆菌表达纯化，采用EV71 VP1 DNA初始免疫-VP1蛋白加强免疫小鼠，探讨初免加强方法对EV71 VP1 DNA疫苗的影响；将pcDNA -VP1质粒分别以肌注、电转2种免疫途径免疫小鼠，评价不同免疫途径的免疫效果。试验结果表明，EV71 VP1、VP2 DNA疫苗在小鼠中能够诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应；共同免疫IL-12或GM-CSF基因增强了VP1特异性的抗体水平和脾淋巴细胞的增殖反应，提高了其分泌IFN-Y和IL-4的水平，因此IL-12和GM-CSF基因是EV71 VP1 DNA疫苗很好的免疫佐剂；VP1 DNA初始免疫-VP1蛋白加强免疫明显增强了VP1特异性的抗体水平和IL-4的分泌水平，显著提高EV71 VP1 DNA疫苗的体液免疫应答；VP1 DNA疫苗采用肌注免疫效果优于电转免疫。本课题从佐剂、免疫途径等方面研究EV71 DNA疫苗的免疫效应，为EV71疫苗的研制和免疫学机制的探讨奠定了基础。