基于多维超滤-谱效结合的西青果抗肺炎克雷伯菌药效物质筛选和多靶点作用机制研究

Klebsiella pneumoniae (K. Pneumonia) is the main pathogen of hospital acquired pneumonia. Preliminary study found that Xiqingguo could cure K. Pneumonia infection by inhibiting proliferation and toxicity, which indicate a need to find multi-target compound. However, the virulence of bacteria is dependent on the bacteria activity, if some compounds have antibacterial effect, it is difficult to find a cytotoxic inhibitor.To solve the above problems, this project uses Xiqingguo as a case, and establish a multidimensional ultrafiltration- spectrum activity integrative strategy to screen antibiotics from traditional Chinese medicine. To carry out the following contents: (1) Evaluate and validate the inhibition effect ofXiqingguo on bacterial infection based on whole cell and animal model. (2) Identification of chemical constituents and metabolites of Xiqingguo, constructactive ingredients spectrum and medicine-source component spectrum. (3) Through the multidimensional ultrafiltration- spectrum activity integrative strategy, screen the bioactive component and target of Xiqinguo on inhibition bacterial proliferation and toxicity, and find the synergistic components. (4) Based on different downstream mechanisms of different phosphodiesterase c-di-GMP pathway, investigate the actual effect and mechanism of protein binding compound. To provide the methodological basis for the selection of antibacterial components of Chinese traditional medicine.

肺炎克雷伯菌是获得性肺炎的主要多重耐药菌，已成为临床上急需解决的难题。前期实验表明，西青果可以通过同时抑制肺炎克雷伯菌的繁殖和毒性起效，提示我们有必要寻找多靶点抑菌组分。但研究中药抑制细菌毒性的前提是存活的细菌，如某些成分能抑制细菌繁殖，势必会影响发现其他抑制细胞毒性的活性成分。因此本项目以西青果为例，拟建立多维超滤-谱效结合的中药抗菌药效物质筛选策略，开展以下研究：（1）基于整体细胞和动物感染模型验证西青果抑制细菌感染宿主能力。（2）利用UHPLC-QTOF MS技术，对西青果化学成分和体内代谢产物进行鉴定，构建化学成分谱及体内药源性成分谱。（3）通过多维超滤-谱效结合策略，对西青果抑制细菌繁殖和毒性的成分与靶点进行分离筛选，找到具有协同作用的活性组分。（4）基于磷酸二酯酶系对c-di-GMP通路产生的不同作用，验证活性组分产生的实际药效，从而为中药抗菌药效成分筛选提供方法学依据。

肺炎克雷伯菌是获得性肺炎的主要多重耐药菌，已成为临床上急需解决的难题。本项目完成以下研究内容：（1）成功建立人肺上皮细胞感染模型，实现对西青果抑制细菌感染的验证。（2）利用UHPLC-QTOF MS技术，对西青果化学成分和体内代谢产物进行鉴定。以质谱行为（精确分子量与二级碎片）和色谱行为（保留时间）的相似性为依据，从血浆、尿液或粪便中共提取14个原型成分，其它15个化学成分因含量较高也纳入代谢分析。通过I相与II相代谢规律，寻找可能的代谢物并将原型与代谢型成分进行关联，以柯里拉京（Corilagin）等部分代谢物为例，对代谢化合物鉴定和匹配，发现多数化合物在30 min可达到最高血药浓度，通过完成体内药源性成分鉴别，从而构建代谢产物谱。（3）通过超滤技术联用高分辨液相质谱策略，经二次超滤，发现其中11个成分与磷酸二酯酶产生结合，包括柯里拉京，诃子酸和柯黎勒酸等西青果中的主要成分，同时也发现此类成分也是血液中检出的主要成分。（4）基于磷酸二酯酶系对c-di-GMP通路产生的不同作用，选取柯里拉京与细菌作用后，通过转录组测序试验和Q-PCR基因验证试验，发现对甘油代谢相关基因（glpD、glpF）、群体感应相关基因（lsrA、luxS、luxR）、细菌毒素相关基因（Hla）、鞭毛生成相关基因（csgB）和鞭毛运动相关基因（fimH、motB、qseB）都有明显的下调趋势，提示柯里拉京能够通过c-di-GMP通路，抑制生物膜形成相关基因的表达从而降低细菌的黏附作用，并减少细菌群体感应的发生，从而为中药抗菌药效成分筛选提供方法学依据。（5）通过项目实施，培养硕士研究生2名，本科生6名，发表SCI收录论文2篇，参与国内外交流2次，获得省部级科技进步奖2项，指导学生参加省级竞赛1次。（6）以技术开发的形式与企业成功研发“劲消宝藏青果抑菌乳膏”并通过第三方检测完成报批手续。