迪茨氏属菌的石油降解基因及调控机制研究

It is reported that alkB and cytochrome P450 (CYP153) genes can be cloned from many oil-degradation bacteria. Meanwhile, there studies mostly focus on the gene detection, but the concrete functional regulation mechanism is still not clear. The aim of present study is to further research the function and regulation mechanism of Dietzia sp.DQ12-45-1b key oil-degradation alkB and CYP450 family (including 13 subtypes ) genes based on the work that we have done in our lab. To achieve this goal, the Dietzia sp. DQ12-45-1b alkB and CYP450 genes over-expression by transformation alkB-expressed plasmid into bacteria and low expression by group II intron to insert themselves ef?ciently into virtually desired DNA target site via the activity of an RNA-protein complex (RNP) will be construct by molecular and gene knockout technology. Then detect the oil-degradation capability of different types bacteria. AlkB and CYP153 transcriptional start site of Dietzia sp. DQ12-45-1b will be analyzed by SI nuclease protect experiment and primer extention experiment. The alkB and CYP153 gene cluster transcriptional control model and protein expression control will be study by reporter genes and DNase protect experiment .The further research of alkane hydroxylase alkB and cytochrome P450 genes will contribute to construct engineering bacteria for the third crude oil extraction and bioremediation for environmental contamination.

本项目拟在本实验室分离纯化的迪茨氏属菌Dietzia sp.DQ12-45-1b 工作的基础上，进一步深入研究石油降解基因alkB和CYP450家族（CYP153是其中一个亚型）基因在石油降解中的协同功能及调控机制。通过分子克隆技术构建alkB和CYP450家族基因的高表达菌株及alkB和CYP450功能缺陷菌株，之后观察不同菌株型对烷烃的石油降解功能；通过SI核酸酶保护实验和primer extension实验，报告基因，RNase保护实验，分析Dietzia sp.DQ12-45-1b中alkB和CYP153基因簇的转录起始位点，转录调控模式和机制；比较alkB和CYP153的转录调控方式，阐明alkB和CYP153在调控水平的协同机制。alkB和CYP450基因功能研究的深入, 将为三次石油生物开采和环境石油污染的生物修复工程菌开发提供理论依据。

Dietzia spp. 在微生物采油、石油污染环境的修复及制药行业有很大的潜在应用，进一步研究其基因功能显得尤为重要。但是由于外源DNA转化至Dietzia spp.效率较低，增加了基因操作的难度。本研究在单因素和正交实验的基础上，研究了物理因素[感受态细胞浓度(A)，电击时间(B)，场强(C)]和化学因素[甘氨酸(D)，异烟肼(E)，吐温80(F)和青霉素(G)]对电转效率的影响。并在优化后高转化效率的基础上，建立了单同源臂线性DNA片段对目的基因的敲除体系。初步分析Dietzia sp.DQ12-45-1b中alkB 基因簇的转录起始位点，转录调控模式。.本文的主要结论是：.1..单因素对Dietzia sp. DQ12-45-1b 的电转效率有不同程度的影响。.2..七种因素对电转效率影响的强度依次是C > D > F > G > B > A > E，提示场强，甘氨酸和吐温80对提高电转效率具有较强的作用。.3..按正交实验优化的最佳条件，综合七种因素，Dietzia sp. DQ12-45-1b的电转效率可以达到2.51 × 107 CFU/μl DNA。迄今为止，这是Dietzia spp.达到的最高电转效率，为菌株的基因操作提供了基础条件。.4..单同源臂线性DNA片段电转至菌体后，首先发生自我环化，类似于自杀性质粒，然后在细菌DNA复制繁殖过程与靶向DNA片段发生重组，生成目的基因突变的菌株。.5..单同源臂线性DNA片段基因敲除体系不需要任何质粒，能够在菌体内环化即可用于目的基因的敲除。.6..AlkW1基因的启动子位于以转录起始位点为基准的-57~+8的区域范围内。alkwR能够抑制alkW1基因的启动子活性。十四酸和十六酸能够抑制alkwR结合DNA的活性，而十四烷、十四醇、十六烷和十六醇均不能抑制alkwR蛋白活性。