Kartogenin预处理促进TGF-β3诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化及阻抑骨化的机制研究

How to effectively promote the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) differentiation into chondrocytes and maintain the chondrocytes phenotype in order to avoid ossification are the hotspot and difficult problem in cartilage tissue engineering. We have previously found that BMSCs could be promoted to chondrogenesis and inhibitted for ossification when BMSCs were pretreated by a new small molecule named kartogenin (KGN) in vitro, and then induced by traditional inducing factor of transforming growth factor β3 (TGF-β3). However, the pathways KGN promoted BMSCs chondrogenesis and inhibitted ossification were still unclear. The target of KGN for signaling pathway was runt related transcription factor 1(RUNX1). Besides, the evidences have shown that the imbalances of RUNX1/RUNX2 were key factors to cause cartilage ossification. Therefore, this project will further clarify the relationship of KGN and RUNX1/RUNX2 in based of preliminary experiment. Furthermore, the related signaling pathway will be screened by protein chip, in order to find related protein molecules which may regulate RUNX1/RUNX2 signaling pathway. Finally, these screened protein molecules wil be verified by in vitro cell biology experiment to clarify the molecular mechanism of KGN in chondrogenic differentiation and ossification inhibition of BMSCs induced by TGF-β3. This project will provide the experimental basis for the clinical application of cartilage tissue engineering.

如何有效促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成软骨分化并维持软骨细胞表型以避免骨化是目前软骨组织工程研究的热点和难点。我们前期研究发现BMSCs经小分子化合物Kartogenin（KGN）体外预处理一定时间，再利用TGF-β3常规诱导可以促进成软骨并抑制骨化，但具体机制不明。KGN与RUNX1密切相关，且已有证据表明RUNX1/RUNX2失衡是引起软骨骨化的关键因素。本项目拟在前期研究基础上，探讨RUNX1/RUNX2信号通路在KGN预处理促进BMSCs成软骨及阻抑骨化中的作用，并利用蛋白质芯片技术筛选相关信号通路靶标，发现与调控RUNX1/RUNX2信号通路可能相关的蛋白质分子，再运用基因过表达、沉默等技术验证所筛选的信号分子对RUNX通路的调节作用，以阐明KGN预处理促进TGF-β3诱导BMSCs形成更为稳定的软骨组织并阻抑软骨内骨化的作用机制，为组织工程软骨走向临床应用提供实验依据。

基于间充质干细胞的软骨组织工程，为一系列软骨缺损问题提供了良好的解决之道，诸如长段气管缺损。但是目前常用的含有TGF-β3的软骨诱导体系存在诸多问题，例如诱导效率低，所得软骨细胞表型不稳定。在本研究中，为了优化人脐带间充质干细胞的成软骨分化，我们将小分子化合物Karotogenin（KGN）预处理与TGF-β3常规诱导进行结合，即先用KGN预处理间充质干细胞3天，之后再使用含有TGF-β3的常规成软骨培养液进行诱导28天。诱导完成后，通过免疫组化和RT-PCR检测细胞中成软骨/骨化相关基因的表达情况。为了进一步探究KGN预处理所带来成软骨优化作用的分子机制，我们使用磷酸激酶检测试剂盒筛选KGN预处理前后，磷酸化水平发生显著改变的蛋白质，并通过应用相应的阻断剂和激活剂进行体外/体内验证。我们发现KGN预处理后，间充质干细胞开始表达软骨前体干细胞标志物FGFR-3，此外，经KGN预处理的间充质干细胞能够在TGF-β3的诱导下向成熟透明软骨细胞分化。并且，与单纯经由TGF-β3诱导所得的的软骨细胞相比，由KGN预处理后的间充质干细胞分化而来的软骨细胞有更高的成软骨基因表达，同时骨化相关基因的表达水平被抑制。磷酸化激酶筛选实验发现：KGN预处理对TGF-β3介导的干细胞成软骨分化的优化作用可能与上调JNK的磷酸化及抑制β-catenin的总蛋白水平直接相关。我们进一步通过JNK阻断剂SP600125和（或）β-catenin激动剂SKL2001进行阻断/激动功能实验。结果发现：KGN预处理促进TGF-β3介导的软骨分化的作用通过激活JNK/RUNX1通路实现，而其阻抑骨化的作用与抑制β-catenin/RUNX2密切相关。最终，我们应用KGN预处理的间充质干细胞和负载TGF-β3的PLCL/collagen纳米静电纺材料构建组织工程气管补片，并成功用于兔气管局部缺损的修复。综上，KGN预处理能够诱导间充质干细胞进入软骨前体干细胞阶段，此阶段的干细胞具有增强的JNK磷酸化水平和降低的β-catenin水平。这种包含KGN预处理和TGF-β3诱导的新型成软骨方案更适用于间充质干细胞的软骨组织工程。此外，在本项目的资助下，我们进行了延伸研究，初步发现KGN预处理的MSCs所产生的外泌体具有促进天然MSCs向软骨细胞定向分化的作用，但该作用的分子机制尚不明确，目前正在深入研究中。