基于转录组测序的榛属植物S位点基因克隆及其功能分析

It is known that there is self- and cross-incompatibility in Corylus (hazelnut). Pollen-stigma incompatibility in hazelnut is of the sporophytic type and controlled by a single locus, designated the S locus, with multiple alleles (haplotypes). To create an accurate and fast method to identify S locus genes and study their expression pattern and protein interaction, are the mainly important scientific questions for the production and breeding in Corylus. In this study, S locus genes will be cloned for the first time based on the transcriptome sequencing data from the critical period of the pollen-stigma reaction. Fluorogenic quantitative PCR and tissue in situ hybridization will be used to analyze the expression pattern of the genes. According to the results of the cross compatibility of the main cultivars and the cultivars with the known S haplotypes, the molecular indentify method for S locus genes will be established and the dominance/recessive relationship will be deduced. Yeast two-hybrid method will be used to explore the protein interaction of the male and female determinant. The functional region and the conditions of the recognition will be analyzed. Based on the results of the contents mentioned above, the molecular mechanism of the sporophytic self-incompatibility in woody plants will be further discussed. The contents in this study have significantly theoretic importance to the compatibility research in Corylus, meanwhile, will benefit for breeding program planning and pollinizers selecting in orchard.

榛属植物存在自交（杂交）不亲和现象（孢子体型），在遗传上受单一位点的多个S等位基因的控制，创建精准、快捷的榛属植物S位点基因鉴定方法，并对其进行表达分析和功能验证，是目前榛子生产和育种面临的重要科学问题。本研究将基于授粉识别关键时期的转录组测序数据，首次在榛属植物中开展S位点基因克隆研究，采用荧光定量PCR和组织原位杂交的方法进行基因的时空表达分析；结合现有品种亲和性研究结果和已知S基因型的品种材料，建立榛属植物S位点基因的分子鉴定方法，并推导其显隐性关系；采用酵母双杂交的方法进行雌雄性决定因子的蛋白质互作研究，分析二者相互识别的功能区域和所需条件，探索木本植物孢子体自交不亲和的分子机理。对于研究基础较薄弱的榛属植物，上述研究既能为榛属植物的亲和性研究增添新的内容，又可解决育种和生产中的关键技术问题，将具有重要的理论和实践意义。

良好的授粉受精是坚果生产和种质创新的基础，亲本间的授粉亲和性是最核心的环节。榛属植物存在自交（杂交）不亲和现象，在遗传上受单一位点的多个S等位基因控制。创建精准、快捷的榛属植物S位点基因鉴定方法，探讨其在授粉识别过程中的作用，是目前榛子生产和育种面临的重要科学问题。本研究基于对“平欧杂种榛不同亲和性组合、授粉后不同时期下转录组”数据的分析，采用同源比对的方法证实，榛属植物中无配子体型自交不亲和S基因，而与芸薹属植物孢子体自交不亲和S基因及下游相关基因均具有一定的同源性，属于典型的孢子体自交不亲和类型；研究克隆得到了孢子体自交不亲和雌性决定因子SRK（包括3个单倍型全长）和SLG基因，SRK1基因全长2549 bp，SRK2基因全长2436 bp，SRK3基因全长2454 bp，具有SRK基因典型的结构特征，均由胞外结构域、跨膜结构域和激酶结构域3部分组成，SLG基因全长1248 bp，基因序列主要由胞外S区域构成，与SRK基因序列一致性为99.51%；研究构建了平欧杂种榛实时荧光定量PCR技术体系，并筛选出适于荧光定量分析的内参基因ChaActin和ChaEF1-α；双色原位荧光杂交表明，SRK基因定位在雌蕊乳突细胞中，荧光定量分析表明该基因在雌蕊中具有较高表达，参与了亲本授粉识别的过程，同一品种中2个SRK基因单倍型的表达量存在差异；根据3条SRK基因及芸薹属SRK基因序列，设计了SRK基因跨S区域的通用简并引物，成功在榛属植物其他种和品种中进行了SRK基因S区域的扩增，为榛属植物S位点基因的鉴定创建了精准、快捷的方法。上述研究既为榛属植物的亲和性研究增添了新的内容，又可解决育种和生产中的关键技术问题，项目成果将在榛属植物授粉树选择、杂交亲本选配等研究和实践中具有应用前景。