ASCL2激活自噬信号网络在胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药中的作用及机制研究

Primary temozolomide resistance is critical in treatment of glioblastoma and autophagy is one of the most important mechanism in it, inhibitors of autophagy have applied in clinical trials. However, autophagy-intervene therapy is restricting for lacking persistent autophagic inhibitor. Our group have revealed that ASCL2 is indispensable for tumorous malignant transformation. Through analysis of Gene Expression Omnibus（GEO）database, we found ASCL2 could be the core regulator of autophagic network, and ASCL2-regulated autophagy in temozolomide resistance of glioblastoma is still not clear. Base on previous data, we plan to seek the target molecules regulated by ASCL2 in autophagy, elucidate the function and mechanism of ASCL2 regulated-autophagy in temozolomide resistance. With CRISPR/Cas9, we attempt to constantly inhibit autophagic activity through ASCL2 knockout, to assure that ASCL2 is valuable for improving the temozolomide-sensitivity in glioblastoma. Our work is not just illuminate the function of ASCL2 in autophagy, but also provide clues for clinical application of autophagy-intervene therapy.

原发性替莫唑胺耐药是影响胶质母细胞瘤临床疗效的关键问题，而自噬在其中发挥着重要的作用，自噬抑制剂已应用到胶质母细胞瘤临床试验中。但是，由于缺乏持续有效的抑制剂，自噬干预疗法的发展受到极大限制。本课题组前期研究发现转录因子ASCL2在肿瘤的恶性转化中发挥重要功能，通过Gene Expression Omnibus（GEO）数据库分析发现ASCL2可能是自噬信号通路转录调控分子，而国内外研究对ASCL2激活自噬信号通路在胶质母细胞瘤原发耐药中的功能及机制并不清楚。本项目拟在前期工作基础上，通过ChIP-Seq勾勒ASCL2调控自噬信号网络，寻找其中关键节点分子；通过过表达及敲低模型阐明ASCL2在胶质母细胞瘤中激活自噬网络对替莫唑胺原发性耐药的作用；在体内原位瘤模型中通过CRISPR/Cas9系统干预ASCL2，持续抑制肿瘤自噬水平，明确靶向ASCL2在提高胶质母细胞瘤替莫唑胺敏感性中的价值。

胶质瘤是一种中枢神经系统常见的恶性肿瘤，胶质瘤干性表型是维持胶质瘤恶性增殖潜能及成瘤能力的重要机理，参与了胶质瘤的发生、侵袭、复发和药物抵抗，靶向干性表型是治疗胶质瘤的重要途径。自噬是一种将胞浆内的物质转运到溶酶体进行降解的高度保守的生物学过程。自噬可以通过强化干性从而促进肿瘤进展和治疗抵抗，自噬抑制剂已广泛应用到肿瘤的临床治疗中。但是目前自噬维持胶质瘤干性表型的关键分子并不清楚，缺乏针对干性表型的自噬抑制剂应用靶点，导致胶质瘤的自噬抑制剂治疗效果并不理想。因此，深入研究自噬在胶质瘤干性维持中的机制，筛选、鉴定、验证在胶质瘤干性表型维持中发挥核心作用的关键分子，对于提高自噬抑制剂的临床治疗效果具有重要意义。.主要研究内容及结果如下：.1. 筛选并鉴定ATG9B是自噬信号通路中维持胶质瘤干性的关键分子：（1）通过数据库筛选发现ATG9B在数据库中与干性相关，与预后相关。（2）ATG9B在胶质瘤临床样本中表达显著升高，且与胶质瘤干性表型显著相关。（3）敲低ATG9B抑制胶质瘤本底自噬活性。（4）敲低ATG9B抑制胶质瘤体外干性表型。（5）敲低ATG9B抑制胶质瘤体内成瘤能力及恶性增殖能力。.2. ASCL2通过ATG9B介导的自噬维持胶质瘤干性表型：（1）筛选并鉴定调控ATG9B的干性转录因子ASCL2。（2）ASCL2通过结合到ATG9B转录起始区激活ATG9B的转录活性。（3）过表达ASCL2上调胶质瘤本底自噬活性。（4）过表达ASCL2增强胶质瘤干性表型及体内移植瘤生长。（5）ASCL2通过ATG9B介导的自噬维持胶质瘤干性表型。.3. ASCL2-ATG9B信号轴的临床转化意义：（1）ASCL2与ATG9B在胶质瘤临床样本中显著相关。（2）ASCL2-ATG9B 信号轴在胶质瘤临床样本中的表达与分级、分型及预后相关。（3）自噬抑制剂ROC-325显著杀伤ASCL2高表达胶质瘤。.综上所述，本研究通过数据库筛选及功能学实验发现ASCL2-ATG9B信号轴介导的自噬信号通路在胶质瘤干性维持中的核心作用，并通过临床样本证实ASCL2-ATG9B在胶质瘤患者分子分型中的价值，初步筛选出针对ASCL2-ATG9B信号轴的自噬抑制剂，为胶质瘤自噬抑制剂的临床应用提供了重要依据。