铜调节缺氧诱导因子1转录调控特异性的作用机制

Hypoxia inducible factor-1(HIF-1) is a transcriptional factor activated under hypoxic conditions. HIF-1 regulates >100 genes encoding for different metabolic enzymes and growth factors. But the regulation by HIF-1 of these genes does not occur at the same time under hypoxia. We have already found that copper specially regulated HIF-1 transcriptional activity. However the mechanism of copper involvement is unknown. To study the mechanism, a number of molecular biology and proteomics techniques are to be used in this study. Using the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), we will research in the following three aspects: (1) the interaction between CCS and HIF-1; (2) the affection of CCS on HIF-1 transcriptional regulation; (3) are there other copper proteins except for CCS in the HIF-1 transcriptional complex, and what is the effect of the copper proteins? The results will provide the basis for the clinical medication targeting HIF-1.

缺氧诱导因子1（HIF-1）是细胞在缺氧条件下激活的基因调控转录因子，对下游靶基因转录调控存在时空特异性。申请人首次发现铜能调节HIF-1转录调控的特异性，机制尚不清楚。为了研究铜调节HIF-1转录调控特异性的作用机制，申请人拟在已有研究基础上，以人脐静脉内皮细胞为模型，采用分子生物学、蛋白组学等技术，从（1）CCS与HIF-1在细胞核内的相互作用、（2）CCS对HIF-1调控基因转录作用的影响、（3）探索HIF-1转录复合物中其他含铜蛋白的存在与作用三方面展开研究，揭示铜调节HIF-1转录调控特异性的作用机制，为以HIF-1作为治疗靶点的药物应用于临床提供新的理论依据。

低氧诱导因子1（HIF-1）是机体应答低氧应激反应的重要转录因子，可以调控一百多个基因的表达，而这种调控作用存在时空特异性。本研究首次发现，铜能调节HIF-1转录调控的特异性。为了揭示铜调节HIF-1转录调控特异性的机制，本研究进行了以下几个方面的工作：. （1）以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为实验材料，于培养基中加入铜特异性螯合剂TEPA使细胞处于缺铜状态，考察此时细胞中10种受HIF-1调控基因的表达情况。结果发现促凋亡调节蛋白3（BNIP3）等5种基因的转录水平受到抑制，而胰岛素样生长因子-2（IGF-2）等5种基因转录水平不受缺铜的影响。. （2）氯化钴处理HUVECs以诱导HIF-1α聚集，采用染色质免疫共沉淀（ChIP）的方法确定目的基因中与HIF-1复合物结合的缺氧应答元件（HRE）序列。再在生理铜浓度以及缺铜的条件下，运用ChIP技术和qPCR两种方法联合检测在BNIP3和IGF-2两个基因中，HIF-1复合物与其启动子上HRE序列的结合情况。实验结果发现，HIF-1复合物中的HIF-1α和HIF-1β两个蛋白在缺铜的情况下，与BNIP3启动子上的HRE序列的结合水平下降，补铜后有所回升；但两者与IGF-2启动子上的HRE序列的结合水平并没有发生明显变化。实验说明铜通过调控HIF-1复合物与其下游基因启动子上的HRE序列的结合，从而调节了HIF-1转录的特异性。. （3）氯化钴诱导HIF-1α聚集，或同时TEPA螯合细胞内的铜，提取HUVECs核蛋白，①采用免疫共沉淀（Co-IP）的方法，以HIF-1α的抗体来富集细胞核中能与HIF-1结合的蛋白复合物。②通过金属离子亲和色谱（IMAC）将能与铜结合的蛋白富集分离出来。质谱分析鉴定以上两个实验中两种处理组中的差异蛋白，再把两个实验中差异蛋白进行对比，找出共同的蛋白。通过上述两种方法的比较分析，共获得9种可能影响HIF-1转录活性的铜结合蛋白。. 本研究初步揭示了铜调节HIF-1转录调控特异性的机制，9种含铜蛋白是全部参与调控还是其中一种或多种参与调控作用，以及如何调控等问题还有待进一步研究。更深层次的研究成果将为以HIF-1为治疗靶点的药物应用于临床提供理论依据。