西瓜果肉颜色关键基因LCYB和NCED的功能分析

The composition and content of carotenoids are related with the different flesh colours in watermelon fruit, which have effects of antioxidant, anti-tumor, protecting the cardiovascular and cerebrovascular et al. Lycopene and xanthophylls serve as the main components of carotenoids and they are agronomically important quality characterizations in watermelon breeding. The quantitative trait loci (QTL) analysis of carotenoids content using a F2 population developed from a cross between the two lines of watermelon LSW-177 (red-flesh and high lycopene) and Cream of Saskatchewan (short for ‘COS’, pale-yellow flesh and low lycopene) was performed. Two genes, ClLCYB and ClNCED, determining the red-flesh and yellow-flesh in watermelon fruit, respectively, had been obtained. In the project, the functions of two genes ClLCYB and ClNCED will be identified by promoter analysis, RNA-seq, site-directed mutagenesis, RNAi and over-expression, respectively. Combination these results with physiological measurement and expression profiles of the genes involving in the carotenoids biosynthetic and metabolic pathways will help illuminate the mechanism for flesh colour formation in watermelon. Our research will also provide some basis research for understanding the regulatory mechanism of carotenoids accumulation and degradation in watermelon fruit. Furthermore, it will provide valuable genes resource to improve important quality traits in flesh color of watermelon and to breed new watermelon cultivars of high quality.

类胡萝卜素物质的组成和含量直接决定西瓜果肉的颜色，具有抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管等功效。番茄红素和叶黄素是类胡萝卜素的主要成分，是西瓜育种重要的品质性状。本项目组已利用西瓜高代自交系“LSW-177”（红色果肉、高番茄红素）与“COS”（浅黄色果肉、低番茄红素）作为亲本材料，配制F2代群体，开展类胡萝卜素含量QTL分析，获得了决定西瓜果肉红颜色和黄颜色的ClLCYB和ClNCED基因。本项目拟分别采取启动子片段缺失、转录组测序、定点突变、RNAi干涉和过表达等技术手段，研究ClLCYB和ClNCED基因功能。在明确其生物学功能基础上，结合转录组学及代谢通路分析，阐明西瓜果肉颜色形成的分子机理，为探明西瓜果实类胡萝卜素积累和代谢途径奠定基础，进而为改善西瓜颜色等重要品质性状，选育优质西瓜新品种提供重要基因资源。

西瓜（Citrullus lanatus L.）是一种世界性瓜类园艺作物，因富含类胡萝卜素而具有丰富瓤色。不同西瓜品种果实中类胡萝卜素组成和含量的多样性导致果肉呈现不同瓤色。本研究分别从LSW-177和COS材料中克隆得到西瓜番茄红素β-环化酶基因Cllcyb-177和Cllcyb-cos，序列分析显示这两个基因存在三个核苷酸差异。生物信息学分析显示在高等植物中LCYB蛋白226位置氨基酸高度保守均为Phe。利用类胡萝卜素工程菌的颜色互补试验和高效液相色谱对两个LCYB基因编码的酶活性进行鉴定，结果表明在原核表达系统中Cllcyb-177和Cllcyb-cos蛋白都具有生物活性，能够高效地将番茄红素环化为β-胡萝卜素，且无显著差异；Cllcyb蛋白序列中Ala168突变为Glu168会导致蛋白丧失环化酶活力；Phe190-Ile208突变为Leu190-Phe208时，同样会导致Cllcyb蛋白丧失环化酶活力，而将Cllcyb蛋白序列中突变为Leu190-Phe208后，Phe226会使得Cllcyb蛋白环化能力恢复80%；Cllcyb蛋白序列中Pro349-Thr376突变为Ser349-Aln376u 后，会使Cllcyb蛋白的环化能力丧失70%。这为研究氨基酸位点对于西瓜LCYB酶功能的影响提供了基础，同时为通过改变LCYB酶活性以达到改良西瓜果肉中番茄红素和β-胡萝卜素含量提供了新的思路。通过染色体步移技术分别克隆得到西瓜材料LSW-177中番茄红素环化酶Cllcyb基因启动子1775 bp和COS材料Cllcyb基因启动子1644 bp。两份材料的Cllcyb基因启动子仅有部分序列完全相同，在LSW-177材料的Cllcyb基因启动子区域发现特有的AT-rich元件，而COS材料的Cllcyb基因启动子则为水杨酸响应元件TCA-element。分别构建了两材料lcyb基因启动子全长及缺失片段，驱动GUS基因的植物表达载体，结果表明Cllcyb基因在红色西瓜LSW-177和浅黄色西瓜COS果肉中参与不同调控网络。在两材料中，克隆得到了ClNCED1基因，在基因编码区中发现2个氨基酸位点突变；ClNCED2基因编码区存在5个氨基酸位点突变；ClNCED3基因编码区存在1个氨基酸位点突变。西瓜ClNCED家族蛋白在N末端差异较大，可能与蛋白定位有关。