内生真菌对红景天活性成分积累的影响规律及机制研究

The wild Rhodiola plant, growing at high altitude mountain areas, whose resource reserves were sharply reduced. The cultivated plants, however, often contain less bioactive component under low altitude conditions. More research showed that it was diffucult to solve the problem through simple changing its growth environment conditions. The endophytic fungi can have an important impact on the secondary metabolic pathway in plant because their long-termed mutual effect and co-evaluation, which will be a new researching area of the optimization to the quality of traditional Chinese medicine. To research the accumulating rule of six bioactive components in Rhodiola plant, the co-culture system was established from endophytic fungus and seedling which were obtained from the wild Rhodiola plants. The accumulation rule of intermediate metabolites will be studied by metabonomics method on the base of salidroside metabolism. The "fungal elicitor" composition and signaling pathway will be clarified by using genetic engineering technologys. The molecular mechanism and the key gene expression rules of salidroside biosynthesis in Rhodiola plant will be studied. The result of this study gives a new way to improve the cultivated Rhodiola quality and to provide scientific basis for the change of traditional views to the genuineness of Chinese traditional medicinal plant.

高山植物红景天野生资源蕴藏量急剧降低，而较低海拔人工栽培面临的主要问题是栽培苗有效成分含量大大降低。单纯改变环境条件难以解决这一问题。某些内生真菌与宿主关系密切，对宿主次生代谢途径产生重要影响，是药用植物品质研究的新方向。课题组通过野生红景天获得内生真菌和无菌组培苗，建立真菌与红景天植物的共培养体系，考察内生真菌对红景天六种主要活性成分积累的影响规律；以主要成分红景天甙的代谢途径入手，通过代谢组学研究其代谢中间物积累规律；采用基因工程技术阐明真菌"诱导子"成分和信号传导途径，研究红景天甙关键合成酶表达规律及关键酶基因活动的分子机制。研究结果对红景天栽培品质的提高提供新思路，也为中药材道地性传统观点的突破和完善提供科学依据。

针对高山植物红景天在低海拔条件下活性成分降低等问题，探索内生真菌对其生长发育、活性成分积累的影响规律及机制。通过研究，课题组获得了我国西藏大花红景天、柴胡红景天，长白山地区的库页红景天、长白红景天等植物的内生真菌612株，经鉴定合并为形态差异的菌株168株，阐明了它们之间的遗传关系，这些真菌具有明显的地域和种属专一性；成功建立了大花红景天组培体系，并用HPLC、1H-NMR等建立了野生红景天、组培苗等的化学指纹图谱库；采用ITS-rDNA、ISSR、RAPD等分子标记方法建立了它们的生物指纹图谱库；采用5种方法综合评价了内生真菌的抗氧化活性，并以此为基础，试验了180株内生真菌对大花红景天发育和活性成分积累的影响，其中，25内生真菌能与红景天互利共生，极少数导致宿主死亡及活性成分下降，其余内生真菌没有明显效果。采用25株真菌试验对宿主的影响规律，结果表明，不同种属的单株真菌对红景天活性成分积累的影响效果各不相同；双株真菌接种，取决于它们之间的拮抗性质而表现出促进与否的生物功能；多株真菌混合接种，没有发现显著促进红景天生长和活性成分积累的增加。内生真菌与宿主共生互作的分子机制研究表明，ZPRa-R-1等菌株与宿主红景天共培养，能够诱导激发宿主植物中NO, SA, H2O2等ROS信号分子的迸发，在第8d, 10d, 12d时，分别达到峰值，同时促进红景天苷合成代谢途径中关键酶基因的表达，其中苯丙氨酸转氨酶（PAL）, 酪氨酸脱羧酶（TyDC）, 尿苷二磷酸葡萄糖转移酶（UDPGT）等关键酶基因表达量明显增加，分别为对照的4.9，2.8，17.1倍；同时采用ISSR、RAPD等标记技术进一步证实了内生真菌能够在DNA遗传水平对宿主遗传性状产生影响；HPLC、1H-NMR等对接种苗活性成分的检测表明红景天苷和酪醇等活性成分积累量呈正相关，为对照的2.8和1.17倍。然而，该菌对酪氨酸转氨酶（TAT）酶基因几乎没有影响。这表明，ZPRa-R-1能够促进了PAL、TyDC和UDPGT为限速酶的合成途径，而对酪氨酸转氨酶相关的途径没有影响。该课题的研究结果表明，内生真菌是红景天生长、发育、活性成分积累的重要因素之一，这为认识内生真菌微生态在药用植物品质形成中的作用、利用内生真菌解决药用植物存在的问题、提高药用植物的品质等，都具有重要意义。