肺炎支原体Ohr样蛋白的结构及功能研究

支原体感染能诱导宿主免疫系统产生活性氧类（ROS），同时支原体自身也能产生及分泌内源性ROS。这意味着支原体必须具备某些相应的抗氧化机制以防止其对自身的氧化损伤以维持持续感染状态。迄今为止尚未在支原体内发现有相应的ROS酶的存在。本课题组在前期研究中发现肺炎支原体（Mp）内存在一有机氢过氧化物（OHP）抗性样蛋白（Ohr）MPN668。本研究拟通过通过Western blotting、质谱分析、Edman测序法分析MPN668亚细胞定位情况；采用基因克隆手段获取rMG454，同源重组方法构建MPN668功能缺失株（ΔMPN668），并将MPN668转染至Ohr失活的铜绿假单胞菌中，研究Mp、rMPN668、ΔMPN668的OHP酶活性以及铜绿假单胞菌的回复突变情况；最后通过X射线衍射法解析其三维空间结构。本研究有利于进一步探讨Mg的免疫逃逸机制，为Mp的治疗靶点开拓新的途径。

本项目按照申请要求对肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）重组MPN668蛋白（rMPN668）是否具有降解有机氢过氧化物（Organic Hydroperoxide，OHP）的能力，并对其结构进行了初步探讨。首先，采用分子克隆和蛋白表达、纯化等方法获得了高纯度的肺炎支原体MPN668蛋白。结果显示，降解有机氢过氧化物叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）以及无机H2O2，其降解能力与rMPN668浓度呈正相关；催化t-BHP时，20ng/μL rMPN668在2min内降解约500μM t-BHP，而催化H2O2反应时，催化效率远低于此水平，200ng/μL rMPN668降解500μM H2O2需要35min以上。RT-PCR分析表明，Mp在不同浓度的t-BHP(0.05M~1.00M)和氢过氧化枯烯（cumene hydroperoxide，CHP）(0.05M~1.00M)条件下，mpn668基因表达水平随着t-BHP和CHP浓度增大而升高；模拟的分子模型显示，rMPN668的二级结构序列为β1-β2-β3-α1-β4-β5-α2-α3-β6，Cys55可能位于其活性中心内。Cys55错义突变后，表达产物的酶活性几乎丧失。同时，通过采用Tn4001转座子和pIVT-1质粒，成功构建了肺炎支原体ΔMPN668突变株，突变株对3种常见的氧化物存在下，生存能力明显低于野生株，尤其是对t-BHP敏感性显著高于H2O2和CHP，此外，将MPN668基因转化至Ohr突变的铜绿假单胞菌中，结果发现铜绿假单胞菌同时获得了抗氧化能力。以上结果表明rMPN668具有氢过氧化物酶活性，能降解有机及无机氢过氧化物。Cys55可能位于rMPN668的活性中心，在酶促反应中可能发挥关键作用。