血小板衍生生长因子受体-α阳性细胞在心脏中的表达和功能

In mammalian heart tissue, cardiac fibroblasts are a heterogeneous group of cells that are the dominant population of cardiac non-myocyte cells that form heterogeneous gap junctional coupling with myocytes in different regions of the heart including sinoatrial node pacemaker tissue. Cardiac fibroblasts are emerging as active and highly plastic cells rather than passive cells that were originally only thought to be involved in extracellular matrix production. Although cardiac fibroblasts represent a significant cell population in the heart, little is known about their distribution, receptor expression, excitability and capability of generating pacemaker activity. In the present proposal we utilize a novel mouse model, engineered to express a histone 2B-eGFP fusion protein in cells that express PDGFRα, to allow specific identification of PDGFRα+ fibroblast-like cells in tissues and in mixed cell dispersions. In this project, I will utilize PDGFRα to characterize the density and distribution of these cells and their relationship with cardiac myocytes. I will also utilize laser technology to capture eGFP+ PDGFR? cells and determine basic expression profiles of channels and receptors that may contribute to the physiological role of these cells in the heart. Cells identified by e-GFP will also be used for patch-clamp experiments to determine the ionic conductances expressed and the function expression of receptors. Preliminary data collected for this proposal has made the exciting observation that cardiac PDGFR?+ cells are excitable and generate robust spontaneous depolarization transients that could have significant impact on normal rhythymicity or in ectopic pacemaking. Results obtained from the specific aims of this proposal would provide a better understanding of cardiac fibroblasts and provide novel ideas of cardiac excitability in health and disease.

在哺乳动物心脏中，成纤维细胞在非心肌细胞中占有绝大多数的数量。心脏成纤维细胞与其它成纤维细胞以及心肌细胞之间形成缝隙连接偶联。心脏成纤维细胞之前被认为是一种不具有兴奋性的细胞，它可以调节心脏的组织结构。而最近的研究表明成纤维细胞是一种具有电生理活性的细胞。本课题我们使用了利用组蛋白2B-EGFP融合蛋白标记的PDGFRα表达细胞的小鼠模型（Pdgfratm11(EGFP)Sor/J老鼠）。利用这种老鼠模型我们可以识别GFRα阳性成纤维细胞，从而观察PDGFRα阳性细胞在心脏的分布密度，与心肌细胞的关系，离子通道的表达。从前期试验中我们发现PDGFRα阳性细胞具有兴奋性并 记录到了非常大的内向电流。通过本课题的研究为我们更好的理解成纤维细胞以及它在病理及生理条件下对心肌兴奋性调节提供了有力的理论基础和新的研究方向。

心脏成纤维细胞在心脏中起到非常重要的重用，它可以通过缝隙连接与心肌细胞形成电偶联从而通过离子通道对心肌细胞兴奋性进行调节。但是由于成纤维细胞缺乏特异性的标记物，所以大部分对成纤维细胞离子通道的研究都是通过细胞培养完成的。本课题通过对血小板衍生因子受体α（PDGFRα） 阳性细胞的研究表明1）PDGFRα阳性细胞存在与心脏的各个部位与心肌细胞紧邻，是一种间质细胞。2）成纤维细胞纯化细胞通过qPCR做进一步确认。这一细胞高度表达PDGFRα低表达其他细胞的标志物。并且PDGFRα阳性细胞高度表达成纤维细胞的标志物vimentin, 表明PDGFRα阳性细胞是成纤维细胞，PDGFRα可以作为成纤维细胞的标志物。这一结果通过免疫组化的方法进一步确认。3）PDGFRα阳性细胞表达连接蛋白connexin43。这一结果表明PDGFRα阳性细胞存在缝隙连接，可与心肌细胞形成电偶联。4）通过PCR方法可以确认PDGFRα阳性细胞表达非选择阳离子通道，其中TRPM7高表达。PDGFRα阳性细胞产生自动内向电流，而TRPM7参与了内向电流的形成，起阻断剂抑制了心肌动作电位。这一结果表明PDGFRα阳性细胞具有兴奋性，并且通过TRPM7参与调节心肌细胞的动作电位的调节。同时在PDGFRα阳性细胞还表达小电导钙激活钾通道和Ano1通道。5）我们发现在PDGFRα阳性细胞上表达ß-2受体和嘌呤类神经受体P2ry1, P2ry2, P2ry4, P2ry6, P2ry13 和 P2rx4表达。并且ß受体激活剂激活非选择性阳离子通道，而嘌呤类神经受体激动剂可以激活钾离子通道和Ano1通道。在生理条件下，肾上腺能神经可能通过PDGFRα阳性细胞上的ß-2受体激活非选择性阳离子通道，进而通过缝隙链接对心肌细胞动作电位调节。在生理条件下，交感神经末梢可以ATP；而在病理条件下，心肌或者心脏成纤维细胞释放ATP。所以在生理或者病理条件下，ATP通过激活SK3 和ANO1活性，经由缝隙链接改变心肌细胞的兴奋性。本课题通过对PDGFRα阳性细胞，可以深入了解心脏成纤维细胞在心脏兴奋性中的作用，为我们对心脏成纤维细胞在心律失常中的作用的研究以及治疗靶点研究提供新的理论基础。