骨髓基质细胞外泌体（exosomes）诱导多发性骨髓瘤细胞耐药的机制研究

The biggest challenge for successful multiple myeloma (MM) treatment is frequent occurrence of drug resistance. Our previous results found that bone marrow stromal cell-derived exosomes, a class of nanometric extracellular vesicles, also facilitate MM drug resistance to Bortezomib though regulating JNK, p38, and p53 signaling pathways. However, detailed exosomal molecules that induced drug resistance have not been identified. Exosomes can affect the function of target cells through their membrane molecules and delivering microRNAs. Therefore, bone marrow stromal cell-derived exosomes may also induce MM drug resistance through regulating signaling pathways in MM cells after binding of exosomal membrane molecules with MM cell receptors and through exosomal miRNA-mediated regulation on target proteins, finally inducing drug resistance. Based on our previous findings, we seek to identify the specific exosomal membrane molecules and cargos which are responsible for exosomes-induced MM drug resistance, and determine the changes of signaling pathways and target proteins using several comprehensive methods, such as receptor antibody array, Small RNA sequencing, flow cytometry, and cell transfection. Our study will favor the development of novel therapeutic strategies by targeting exosomes for overcoming drug resistance, thus improving the MM treatment and prognosis.

目前多发性骨髓瘤（MM）治疗面临的最大障碍就是耐药的产生。申请人之前的结果发现骨髓基质细胞分泌的外泌体（exosomes）能够通过调控JNK、p38、p53等信号通路来诱导MM细胞对万珂的耐药，但是其中引起耐药的具体分子还不清楚。由于外泌体可以通过表面分子接触或者传递miRNAs来影响靶细胞的功能，因此我们猜想骨髓基质细胞外泌体可以通过其表面分子与MM细胞受体结合来调控MM细胞内信号通路变化并传递内含的miRNAs来改变相应靶蛋白的表达，最终诱导MM细胞耐药的产生。本项目拟利用受体蛋白抗体芯片技术、Small RNA测序、流式细胞术、细胞转染等实验方法，对外泌体诱导MM细胞耐药的具体表面分子和内含miRNAs进行鉴定，并确认它们各自所影响的通路或者靶蛋白，从而详细地阐明外泌体诱导MM细胞耐药的分子机理，为发展出针对外泌体的靶向策略来克服MM耐药和改善MM治疗提供更充分的科学依据。

骨髓基质细胞对多发性骨髓瘤细胞的生长和耐药起着很重要的支持作用。近年来越来越多的研究表明骨髓基质细胞分泌的胞外囊泡（包括外泌体）能够促进骨髓瘤细胞的生长和耐药，然而其中的具体机制以及参与的分子还不是很明确。包含外泌体在内的胞外囊泡被靶细胞所摄取的通路主要有内吞、胞吞、巨胞饮、膜融合等，外泌体及靶细胞表面的分子决定了摄取的具体通路。通常情况下，有多条不同的摄取通路会参与到靶细胞对外泌体的摄取过程中。因此，揭示骨髓基质细胞分泌的外泌体被骨髓瘤细胞摄取的通路及相关分子将有利于我们理解外泌体诱导耐药的机制，以及找到靶向该通路的方法，从而减轻骨髓瘤细胞的耐药。在本项目中，我们首先从人源的骨髓基质细胞中分离得到外泌体（称为小胞外囊泡），确定了这些外泌体能够促进4种人骨髓瘤细胞系的生长和耐药；而后利用9种靶向内吞、巨胞饮、胞吞和膜融合通路的抑制剂发现了基质细胞分泌的外泌体主要是通过内吞、巨胞饮和胞吞途径被骨髓瘤细胞所摄取；我们利用shRNA慢病毒在骨髓瘤细胞中敲低了包含Caveolin-1，Clathrin heavy chain (CLTC)，Dynamin-2 (DNM2)，Flotillin-1在内的内吞相关分子后，明显降低了骨髓瘤细胞对外泌体的摄取，表明这4种分子都参与了外泌体的摄取；敲低DNM2或CLTC以及内吞抑制剂dynasore都能够在抑制外泌体摄取的情况下，增加细胞对bortezomib的敏感性，进一步说明内吞通路和DNM2以及CLTC参与了外泌体诱导的耐药；此外内吞抑制剂也能够抑制原代骨髓瘤细胞对外泌体的摄取，并且能够在骨髓瘤的小鼠模型中明显增加骨髓瘤细胞对bortezomib的敏感性，延长了骨髓瘤小鼠的生存时间。这些结果就表明骨髓基质细胞外泌体主要通过内吞、巨胞饮和胞吞途径被骨髓瘤细胞摄取，DNM2和CLTC都参与了该过程；通过内吞抑制剂来靶向外泌体的摄取是能够降低骨髓瘤细胞对bortezomib的耐药，从而为克服骨髓瘤细胞的耐药提供了新的策略和证据。