Annexin A2在缺血性脑损伤后血管再生中的作用及机制研究

Annexin A2 is mediated by Ca2+ with a high affinity for phospholipid binding protein. In recent years, its angiogenesis roles in tumor cells were reported, but there is little known in ischemic brain injury. Our preliminary data demonstrated that recombinant annexin A2 protects ischemic brain injury, and the deletion of annexin A2 aggravates ischemic brain injury. We further found that annexin A2 is mainly expressed in vascular endothelial cells around the infarct area, and inhibition of annexin A2 expression decreases angiogenesis. But the mechanism remains to be further studied. In this study, using annexin A2 knockout mice and siRNA interference technique, we intend to explore roles and mechanisms of annexin A2 on cerebral ischemic injury, especially on vascular regeneration. After finishing this work, firstly it will help to clarify roles and mechanisms of annexin A2 on angiogenesis after cerebral ischemia; secondly, it will help to use recombinant annexin A2 or the related signal pathway to treat ischemic brain injury, and help to develop relevant drugs.

Annexin A2是Ca2+介导的具有高亲和力的磷脂结合蛋白，近年来发现其在肿瘤等细胞上具有促血管生成等作用，但其在缺血性脑损伤中的作用还不清楚。我们前期发现重组annexin A2能保护缺血性脑损伤，而敲除annexin A2基因加重缺血性脑损伤。进一步发现annexin A2主要表达在梗死周边区的血管内皮细胞上，而抑制annexin A2的表达后，血管生成能力下降，但其机制还有待进一步研究。在本研究中，我们拟采用annexin A2基因敲除小鼠和siRNA干扰等技术，从整体、细胞角度阐述annexin A2对脑缺血损伤后的影响，重点观察annexin A2促血管再生的作用和机制。本项目的完成，首先有助于明确annexin A2在脑缺血后血管再生的作用及机制；其次有助于利用重组annexin A2或调节相关信号通路来治疗缺血性脑损伤，为相关药物的开发和研究提供借鉴经验。

Annexin A2是Ca2+介导的具有高亲和力的磷脂结合蛋白，近年来发现其在肿瘤等细胞上具有促血管生成等作用，但其在缺血性脑损伤中的作用还不清楚。我们在野生鼠和A2-/-小鼠胚胎期15.5天，10 kDa的示踪剂已经聚集于脑血管中，并没有渗漏现象。而对于550 Da的小分子示踪剂，可以发现在A2-/-小鼠胚胎期15.5天，该小分子示踪剂存在渗漏，而野生鼠却没有渗漏。而在12周的野生型小鼠和A2-/-小鼠的脑组织中，也观察到了同样的现象。以上的实验结果均提示膜联蛋白A2参与血脑屏障功能形成和成熟。进一步提取三个月大的野生型小鼠和A2-/-小鼠的脑微血管内皮细胞，并分析连接复合体的表达水平。发现与野生型小鼠比较，紧密连接蛋白： ZO-1、Claudin-5，、粘附连接蛋白VE-cadherin的表达在A2-/-小鼠脑微血管中明显降低。以上实验证明膜联蛋白A2的缺失会造成血脑屏障功能失调。.使用小干扰RNA（siRNA）将人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中膜联蛋白A2表达沉默，我们发现细胞间的渗透性显著高于对照组。在单层紧密的HBMEC中加入炎症分子白介素-1β （（IL-1β），细胞的渗透性显著增加，而rA2可以逆转这种损伤。进一步，IL-1β+缺氧混合模型能明显增加HBMEC的渗透性，而rA2也能逆转这种损伤。 。提取HBMEC的细胞膜蛋白，并对连接复合体的表达进行了检测。IL-1β+缺氧能降低所有连接复合体蛋白的表达，而给予rA2后，能显著增加ZO-1和VE-cadherin在细胞膜上的表达。以上实验表明，rA2通过影响ZO-1和VE-cadherin的表达以及在细胞中的分布来保护IL-1β+缺氧造成的血管内皮细胞渗透增加。进一步提取了人脑微血管内皮细胞的膜蛋白，使用膜联蛋白A2的特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）。结果显示膜联蛋白A2能够和细胞膜上粘附连接蛋白VE-cadherin以及细胞骨架蛋白F-actin相互结合。IL-1β+缺氧能够减少膜联蛋白A2在HBMEC胞膜上的分布，而给予rA2后，膜上A2的量明显增加。 。这也导致A2和VE-cadherin、F-actin的相互作用增加，进而稳定VE-cadherin 和F-actin在血管内皮细胞膜上的分布，增加细胞的紧密连接性。