运输蛋白微粒复合体4在大肠癌中的作用及其与ERK-MAPK信号通路关系研究

运输蛋白微粒复合体4（TRAPPC4）在肿瘤发生中的作用一直未受重视，我们在前期研究中发现其与ERK2（大肠癌发生中异常激活的重要信号通路ERK-MAPK中的关键蛋白之一）直接结合并涉及大肠癌的发生。本课题期望能通过激光共聚焦、免疫电镜等技术进一步直观了解和验证大肠癌发生中TRAPPC4蛋白的亚细胞定位情况；通过改变ERK2的活性状态观察TRAPPC4的定位以及改变TRAPPC4表达量观测ERK2活化情况，阐明TRAPPC4在大肠癌发生中与ERK2相关的部分作用机制；通过改变TRAPPC4表达量后检测大肠癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、克隆形成能力等影响阐明其表达对于大肠癌恶性表型意义；并在动物整体水平对上述机制和功能进行进一步确认和评估。最终对TRAPPC4在大肠癌中的"定位-作用机制-功能"首次进行系统的阐述，揭示这一大肠癌发生中可能的新分子机制，为探索大肠癌防治新分子靶点奠定理论基础。

运输蛋白微粒复合体4（TRAPPC4）在肿瘤发生中的作用一直未受重视，我们在前期研究中发现其与ERK2（大肠癌发生中异常激活的重要信号通路ERK-MAPK中的关键蛋白之一）直接结合并可能在大肠癌的发生中发生作用。本项目中，我们1）首先通过GST-pulldown方法进一步确定了两者的相互结合。2）通过大肠癌细胞系中改变TRAPPC4的表达量了解其对ERK-MAPK信号通路活性的影响，有以下发现：a]用RNA干扰方法下调TRAPPC4的表达后，通过免疫荧光、Western Bloting等方法检测ERK-MAPK信号通路中的关键酶ERK1/2及其活性形式pERK1/2（磷酸化ERK1/2）的表达和其亚细胞分布情况（主要为核浆分布）；结果显示下调TRAPPC4的表达后胞核内pERK1/2的表达明显减少；b] 用过表达TRAPPC4的质粒转染大肠癌细胞系上调TRAPPC4的表达，通过免疫荧光、Western Bloting等方法检测ERK1/2及其活性形式pERK1/2的表达和分布情况，结果显示上调TRAPPC4的表达后胞核内pERK1/2的表达明显增加。3）通过改变大肠癌细胞系中TRAPPC4表达量后检测其对大肠癌细胞恶性表型的影响（增殖、凋亡和细胞周期情况），结果显示大肠癌细胞系中TRAPPC4的表达下调会抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，促进细胞周期G0/G1期阻滞；而表达上调会促进细胞增殖；4）通过裸鼠成瘤实验，在动物整体水平对上述机制和功能进行进一步确认和评估，结果显示TRAPPC4表达降低会抑制肿瘤生长，而表达增加则会促进肿瘤生长。5）在人体组织学水平上，以正常大肠上皮组织→大肠腺瘤组织（癌前病变）→大肠腺癌组织模拟大肠癌发生中组织学改变的不同阶段，发现大肠癌发生中ERK1/2在胞浆中被异常激活（即磷酸化）为pERK1/2，后者可通过与TRAPPC4结合后被运输入核。总之，本项目的研究揭示了大肠癌发生中TRAPPC4通过与ERK2的相互作用影响pERK1/2核转运，最终影响大肠癌细胞恶性表型（增殖、凋亡、细胞周期）及大肠肿瘤的生物学行为；结合人体组织研究的结果，本项目最终对TRAPPC4在大肠癌中的“定位-作用机制-功能”首次进行系统的阐述，为大肠癌治疗提供重要的分子理论基础和新分子靶点。