BMSCs细胞膜片与仿生β-TCP/COL-I重叠结构成骨效应的筛选优化和成骨机制的研究

The modification of biomimetic material is a key link of bone defect repair. Cell sheet completely remained the extracellular matrix protein such as vinculin. This project is planned ,on the basis of successful preparation of the β-TCP/COL-I scaffold and BMSCs cell sheet , to construct with innovation the three-dimensional osteoinductive structure by curling the sandwich by BMSCs cell sheet and the β-TCP/COL-I scaffold. The struction parameter and cell density of the sheet-scaffold materaial is screened and optimized. It is to investigate the expression of the osteogensis protein in three-dimensional structure , the influence of the sheet-scaffold system for cell adhesion, proliferation, differentiation ,mineralization and the mechanism of bone formation in vitro. Bone defect models are used to confirm the effect of the screening and optimal sheet-scaffold biomimetic materials induced osteogenesis in vivo , so as to provide experimental basis for BMP-2 and VEGF gene-modified sheet-scaffold biomimetic structure used in repairing the bone defects with high innovation and the application prospects.

仿生骨移植材料的组织亲和性是骨移植修复缺损的重要环节，细胞膜片技术完整保留骨架蛋白(vinculin)，细胞间连接蛋白等细胞外基质蛋白（ECM）。本项目拟在以往成功制备仿生多孔β-TCP/COL-I材料和骨髓间充质干细胞(BMSCs)膜片的基础上， 创新性地对BMSCs细胞膜片与仿生β-TCP/COL-I进行组合形成薄层叠层卷曲结构，试图上调骨移植材料的骨诱导性能。通过体外实验，对膜片叠层结构参数及BMSCs细胞密度进行筛选优化；了解该叠层立体结构对BMSCs成骨相关蛋白表达及细胞粘附、增殖分化和矿化的影响及其成骨机制。通过动物实验，证实经优化筛选的BMSCs膜片叠层结构植入体内的成骨效应， 以期为进一步BMP-2和VEGF基因修饰的BMSCs细胞膜片叠层结构促进骨缺损修复效应提供实验依据，具有较高的创新性及应用前景。

具有良好的表面活性并可降解的生物支架材料，结合最大限度保存细胞及胞外基质的细胞膜片，已逐渐成为修复大面积骨缺损的主流手段。本实验成功构建仿生多孔多孔磷酸三钙/I型胶原（β-TCP/COL-I）复合支架，优化筛选其结构参数，获得生物相容性好、成骨效能显著的支架材料；改进电化学沉积胶原的方法对生物材料表面改性，获得更有利于细胞粘附增殖与成骨分化的涂层表面，同时增强其负载蛋白的能力并优化蛋白释放的行为，为后续通过支架材料承载功能性生物分子提供基础；探索BMSCs分离、培养及扩增技术，调控BMSCs膜片的细胞密度及成骨诱导条件，成功制备含多层细胞及丰富的胞外基质的细胞膜片；BMSCs膜片结合β-TCP/COL-I支架层叠结构在体外实验中展示出更高的成骨相关标志物的表达，提示BMSCs膜片与β-TCP/COL-I支架之间可能存在的协同促成骨作用，后续实验中利用ADSCs进一步验证了该层叠结构的成骨效应；构建裸鼠异位皮下成骨模型，植入BMSCs膜片与β-TCP/COL-I支架层叠结构，4周后通过影像学及组织学观察到该层叠结构在体内实验中表现出优异的成骨效能，证明了其与周围组织的亲和性及骨缺损修复的效果，同时进一步验证了细胞水平的实验结果；应用慢病毒、腺病毒、阳离子脂质体等转染手段，构建BMP-2及VEGF基因修饰的BMSCs，获得转染效率高、基因表达稳定的BMSCs，拟进一步探索最佳BMP-2和VEGF基因修饰细胞的比例，以达到最佳的促进微血管和新骨形成效应。本项目研究的开展结果不仅阐明了BMSCs膜片与β-TCP/COL-I支架之间协同促成骨的效应及机制，同时也可为骨缺损修复新材料应用提供科学依据，具有较高创新性与医学意义及潜在的应用前景。目前，课题组已发表SCI论文11篇，国内核心期刊3篇，培养硕士研究生5人，2篇SCI论文及2篇国内核心论文正在审稿中。剩余部分实验结果已整理完毕，正在投稿中。