APC-Cdh1在神经病理性疼痛脊髓中枢敏化中的作用

脊髓中枢敏化是神经病理性疼痛产生的基础，机制复杂。泛素蛋白酶小体系统可通过泛素化降解突触前、后蛋白质分子，在中枢敏化形成中起重要作用。细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex, APC）与其调节亚基Cdh1是细胞内泛素蛋白酶小体系统中的重要成分，最近研究显示其参与神经元突触功能的调控。本研究拟观察神经病理性疼痛大鼠脊髓背角APC-Cdh1及其下游底物的表达变化规律。通过构建Cdh1慢病毒载体，分别上调与下调APC-Cdh1活性。离体培养脊髓片和建立大鼠神经病理性疼痛模型，分别从电生理学、形态学、分子水平、行为学等方面观察调节APC-Cdh1活性对脊髓背角神经元突触可塑性的影响及机制，评价其在中枢敏化形成中的作用。本课题从突触传递的角度，首次研究APC-Cdh1在脊髓中枢敏化中的作用，为探讨一种基于神经病理性疼痛发病机制的治疗途径提供科学依据。

神经病理性疼痛是慢性难治性疼痛的常见类型，主要由中枢或外周神经系统损伤或疾病所引起，表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。脊髓中枢敏化在神经病理性疼痛产生和维持中起着重要作用，其过程涉及突触前、突触后多种蛋白质分子，机制复杂。泛素蛋白酶小体系统可通过泛素化降解突触前、后多种蛋白质分子，在神经病理性疼痛脊髓背角突触可塑性调节中起着重要作用。细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex, APC）与其调节亚基Cdh1是细胞内泛素蛋白酶小体系统中的重要成分。研究发现APC-Cdh1在突触发育和突触传递过程中扮演着重要角色，但其是否参与神经病理性疼痛，国内外尚未见报道。首先，本研究建立外周性神经病理性疼痛模型，通过行为学检测大鼠机械痛阈的变化，免疫组化检测大鼠脊髓背角c-fos的表达与星形胶质细胞的活化情况，证实神经病理性疼痛模型构建成功。通过免疫组化和western blot检测发现神经病理性疼痛大鼠脊髓背角Cdh1表达减少，下游底物蛋白SnoN表达升高，APC-Cdh1相关蛋白EphA4表达减少，说明APC-Cdh1的活性下调与神经病理性疼痛中枢敏化的形成有关。通过免疫共沉淀检测发现APC-Cdh1可能通过与EphA4、GluR1相互作用参与神经病理性疼痛。其次，本研究通过RT-PCR扩增出大鼠Cdh1基因编码序列，通过基因重组及定点突变技术成功构建Cdh1过表达慢病毒载体、对照慢病毒载体及磷酸化位点突变型Cdh1慢病毒载体。体外将Cdh1过表达慢病毒感染原代培养的神经元及星形胶质细胞，研究发现Cdh1过表达慢病毒可抑制缺氧性神经元凋亡和反应性星形胶质细胞增殖。最后，本研究通过鞘内注射慢病毒，在脊髓可检测到标记蛋白GFP的表达，结果显示鞘内注射Cdh1过表达慢病毒可以部分缓解神经病理性疼痛。此外，本研究还发现神经病理性疼痛大鼠前扣带回皮层区Cdh1表达减少，脊髓横断损伤模型(SCI)大鼠脊髓水平APC-Cdh1活性下调。综上所述，本研究结果说明APC-Cdh1活性下调在神经病理性疼痛产生和维持过程中起着重要作用，基于APC-Cdh1活性调节有可能成为神经病理性疼痛治疗的新靶点，并为进一步探讨APC-Cdh1调节神经病理性疼痛作用机制提供科学依据。